増幅断片長多型

キャピラリー電気泳動装置からのAFLPデータの例

増幅断片長多型（AFLP-PCRまたはAFLP）は、遺伝学研究、DNA フィンガープリンティング、および遺伝子工学の実践で用いられるPCR ベースのツールである。1990 年代初頭に Pieter Vos によって開発された[ 1 ] AFLP では、制限酵素を使用してゲノム DNA を消化し、続いて制限断片の粘着末端にアダプターを連結する。次に、制限断片のサブセットが選択され、増幅される。この選択は、アダプター配列、制限部位配列、および制限部位断片内の数ヌクレオチドに相補的なプライマーを使用することで行われる（詳細は後述）。増幅された断片は分離され、アガロースゲル電気泳動上で変性時に、オートラジオグラフィーまたは蛍光法、あるいは自動キャピラリーシーケンス装置によって視覚化される。

AFLPは略語として使用されるべきではありませんが、一般的には「増幅断片長多型」と呼ばれます。しかし、得られたデータは長さ多型としてではなく、存在・不在多型としてスコア化されます。[ 2 ]

AFLP-PCRは、 DNAの多型を検出する高感度な手法です。この手法は、1993年にVosとZabeauによって初めて報告されました。[ 3 ] [ 2 ]この手法の詳細な手順は、以下の3つのステップに分かれています。

  1. 1 つ以上の制限酵素を使用して全細胞 DNA を消化し、制限半部位特異的アダプターをすべての制限断片に連結します。
  2. 対応するアダプターと制限部位特異的配列を持つ 2 つの PCR プライマーを使用して、これらのフラグメントの一部を選択的に増幅します。
  3. ゲルマトリックス上でアンプリコンを電気泳動分離し、バンドパターンを視覚化します。

分析

階層的クラスタリングを用いたAFLP系統解析（樹状図として提示）

前述の通り、AFLPの結果は、存在・不在多型の複数の配列としてスコア化されます。これらの「配列」を比較し、階層的クラスタリングを用いて樹状図を作成することができます。

  • UPGMA（AFLPで一般的に使用される）や近傍結合などの手法では、距離行列が必要です。距離行列の作成方法にはいくつかのアイデアがあります。
    • Hillら（1996）は、NeiとLi（1979）の式を用いて、各離散長さ（0/1マーカー配列）における存在または不在をスコアリングした。[ 4 ]
    • すべてのゲルが1塩基単位で長さを分離できるまで泳動されているわけではない（例として、セクション内の2つの画像が挙げられます）。また、たとえ区別できたとしても、バンドを数えることは誤りになりやすいです。1999年以降、この問題に対処するため、各結果を密度レベルのシーケンス（高さ1ピクセルの画像など）と見なす研究が行われました。これらのシーケンスは、ピアソン相関を用いて相互に比較されます。この方法には、異なる密度レベルを利用できるという利点もあります。[ 5 ]
  • 2つの別々のベイズ法、1つはMrBayesによるもの、もう1つはLuo et al. (2007)によるもので、まず結果を0/1マーカー配列に変換します。[ 6 ]
  • ベイズ法の一つは、密度系列を集団構造パラメータに変換するものである。[ 7 ]

0/1マーカー配列の問題は、優性遺伝することである[ 5 ]。しかし、生態学で用いられる統計手法のほとんどは共優性データを必要とする。AFLP法の結果を密度配列で表現することは、密度の変化が実験誤差ではなく、特定のサイズの核酸の相対量の実際の変化によるものである限り、この問題に対処するのに適している。[ 8 ]

応用

AFLP技術は、異なるゲノム領域における様々な多型を同時に検出する能力を備えています。また、非常に感度が高く再現性も高いです。その結果、AFLPは植物、真菌、動物、細菌の系統または近縁種における遺伝的変異の同定に広く利用されるようになりました。AFLP技術は、犯罪鑑定や親子鑑定、集団内のわずかな差異の特定、そして量的形質遺伝子座（QTL）解析 のためのマップを作成する連鎖研究に使用されています

AFLPには、ランダム増幅多型DNA（RAPD）、制限酵素断片長多型（RFLP）、マイクロサテライトなどの他のマーカー技術と比較して多くの利点があります。AFLPは、他の技術と比較して、全ゲノムレベルでの再現性、解像度、感度が高いだけでなく、[ 9 ]、一度に50～100の断片を増幅することができます。さらに、増幅に事前の配列情報は必要ありません（Meudt & Clarke 2007）。[ 10 ]その結果、AFLPは、細菌、真菌、植物などの分類群の研究において非常に有益となっています。これらの分類群では、様々な生物のゲノム構成について未だ多くのことが分かっていません。

AFLP技術はKeygene NVの特許および特許出願によって保護されています。AFLPはKeygene NVの登録商標です

参考文献

  1. ^ Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T. van de, Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. (1995年11月11日). 「AFLP：DNAフィンガープリンティングのための新技術」 . Nucleic Acids Research . 23 (21): 4407–4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 . ISSN  0305-1048 . PMC  307397. PMID 7501463 
  2. ^ a b Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. (1995年11月). 「AFLP：DNAフィンガープリンティングのための新技術」 . Nucleic Acids Res . 23 (21): 4407–14 . doi : 10.1093/nar/ 23.21.4407 . PMC 307397. PMID 7501463 .  
  3. ^ Zabeau, MおよびP. Vos. 1993. 「選択的制限酵素断片増幅：DNAフィンガープリンティングの一般的な方法」欧州特許庁、公開番号0 534 858 A1、公報93/13。
  4. ^ Hill, M.; Witsenboer, H.; Zabeau, M.; Vos, P.; Kesseli, R.; Michelmore, R. (1996年12月). 「Lactuca属における遺伝的関係を研究するためのツールとしてのAFLPを用いたPCRベースのフィンガープリンティング」.理論・応用遺伝学. 93 (8): 1202– 1210. doi : 10.1007/BF00223451 . PMID 24162531 . 
  5. ^ a bサベルクール、PH;アーツ、HJ;デ・ハース、J;ダイクスホールン、L;デュム、B;オッセン、M;レードメーカー、JL;スクールズ、L;レンストラ、JA (1999 年 10 月)。「増幅されたフラグメント長多型解析: 最先端技術」。臨床微生物学ジャーナル。37 (10): 3083–91 .土井: 10.1128/JCM.37.10.3083-3091.1999。PMC 85499。PMID 10488158。  
  6. ^ Luo, R; Hipp, AL; Larget, B (2007). 「AFLPマーカーの進化と系統学的推論のベイズモデル」.遺伝学および分子生物学における統計的応用. 6 : Article11. doi : 10.2202/1544-6115.1152 . PMID 17474877 . 
  7. ^ Foll, M; Fischer, MC; Heckel, G; Excoffier, L (2010年11月). 「AFLP増幅強度からの集団構造の推定」. Molecular Ecology . 19 (21): 4638–47 . Bibcode : 2010MolEc..19.4638F . doi : 10.1111/j.1365-294X.2010.04820.x . PMID 20874760 . 
  8. ^ Gaggiotti, OE (2010年11月). 「AFLPバンドの蛍光に対するベイズ統計的処理は正確な遺伝子構造推定につながる」. Molecular Ecology . 19 (21): 4586–8 . Bibcode : 2010MolEc..19.4586G . doi : 10.1111/j.1365-294X.2010.04821.x . PMID 20958811 . 
  9. ^ Mueller UG, Wolfenbarger LL (1999年10月). 「AFLPジェノタイピングとフィンガープリンティング」. Trends Ecol. Evol . 14 (10): 389– 394. CiteSeerX 10.1.1.115.2957 . doi : 10.1016/S0169-5347(99)01659-6 . PMID 10481200 .  
  10. ^ Meudt HM, Clarke AC (2007年3月). 「忘れ去られたか、それとも最新の実践か？AFLPの応用、分析、そして進歩」 . Trends Plant Sci . 12 (3): 106–17 . Bibcode : 2007TPS....12..106M . doi : 10.1016/j.tplants.2007.02.001 . PMID 17303467 . 

AFLPデータ解析ソフトウェア

AFLPデータを解析するためのフリーウェア

  • SourceForge Genographer手動スコアリング用の無料ソフトウェア（Java アプリケーション）
  • SourceForge RawGeno無料の自動スコアリング（R CRAN 環境、ユーザーフレンドリーな GUI を含む）

AFLP-PCRシミュレーション用オンラインプログラム

  1. ^ 「GelCompar IIユーザーの皆様へ」 2018年5月8日
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