Cas12a

CRISPR関連タンパク質12a
アシダアミノコッカス属 Cas12a PDB : 5B43
識別子
シンボルCas12a
インタープロIPR027620
利用可能なタンパク質構造:
PDB  IPR027620  
アルファフォールド

Cas12a（C RISPR- as関連タンパク質12a、以前はCpf1として知られていた）は、RNA 誘導性エンドヌクレアーゼ-エキソヌクレアーゼであり、一部の細菌および古細菌に見られるCRISPRシステムの必須構成要素です。[ 1 ]自然環境において、Cas12a はウイルスやその他の外来の可動性遺伝要素の遺伝物質を標的として破壊し、宿主細胞を感染から保護します。他の Cas 酵素と同様に、Cas12a は「ガイド」RNA（crRNAまたはCR ISPR RNAと呼ばれる）に結合し、特定のプログラム可能な方法で DNA 配列に誘導されます。宿主生物において、crRNA は Cas12a タンパク質によって認識される定常領域と、以前に細胞に感染した外来核酸（例えば、ファージゲノムの一部）と相補的な「スペーサー」領域を含んでいます。[ 2 ]

Cas9や他のCasタンパク質と同様に、プログラム可能なDNA標的活性を持つCas12aは、バイオテクノロジーや生物学研究のアプリケーションに有用なツールとなっています。crRNAのスペーサー配列を改変することで、研究者はCas12aを特定のDNA配列に標的化することができ、DNAの高度に標的化された改変が可能になります。[ 3 ] Cas12aは、単一のRuvCエンドヌクレアーゼ活性部位、5'プロトスペーサー隣接モチーフの優先性、切断部位で平滑末端ではなく粘着末端が形成される点でCas9と区別されます。これらの違いやその他の違いにより、Cas12aは特定のアプリケーションにより適している可能性があります。基礎研究での使用以外にも、CRISPR-Cas12aは遺伝性疾患の治療や遺伝子ドライブの実装にも応用できる可能性があります。[ 3 ]

歴史

Cas12aはクラスIIタイプV CRISPR関連ヌクレアーゼで、2015年に特徴が明らかにされ、以前はCpf1として知られていました。[ 4 ]このヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダなどの細菌のCRISPR-Cpf1システムに見られます。[ 5 ] [ 6 ] 2012年に確立されたTIGRFAMsタンパク質ファミリーの定義に由来する最初の名称は、プレボテラとフランシセラの系統におけるこのCRISPR-Casサブタイプの普及を反映していました。Cas12aはCas9とはいくつかの重要な違いがあります。Cas9が生成する平滑末端とは対照的に、Cas12aは二本鎖DNAに交互に切断を生成します。[ 7 ]それは「Tに富む」プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）（典型的には5'-TTTV-3'、ここでVはA、C、またはG）に依存しており、Cas9が好む「Gに富む」PAM（典型的には5'-NGG-3'）と比較して代替の標的部位を提供する。[ 8 ]また、効果的な標的化にはCRISPR RNA（crRNA）のみが必要であるが、Cas9はcrRNAとトランス活性化crRNA（tracrRNA）の両方を必要とする。[ 4 ]

これらの違いは、Cas9に対してCas12aに特定の利点をもたらす可能性がある。例えば、Cas12aのcrRNAはサイズが小さいため、マルチプレックスゲノム編集に適しており、Cas9のシングルガイドRNA（sgRNA）と比較して、1つのベクターに多くのガイドRNAをパッケージ化することができる。[ 9 ] Cas12aによって生成される粘着性のある5′オーバーハングは、従来の制限酵素クローニングよりも標的特異性が高いDNAアセンブリにも利用できる。さらに、Cas12aはPAM部位から18～23塩基対下流のDNAを切断する。この特性により、修復後も認識配列がそのまま残るため、Cas12aは複数回のDNA切断を実行できる。対照的に、Cas9はPAM部位の3塩基対上流のみを切断するため、非相同末端結合（NHEJ）経路からのインデル変異が起こり、認識配列が破壊され、後続の切断が妨げられる。 Cas12aの注目すべき特徴は、Cas9とは対照的に、切断後も標的DNAに結合したまま、他の一本鎖DNA分子を無差別に切断する能力である。この特性は「側方切断」または「トランス切断」活性と呼ばれ、様々な診断技術の開発に利用されてきた。[ 4 ]

Cas9との比較

Cas12aはクラスIIタイプV CRISPR関連ヌクレアーゼに分類されていますが、Cas9にあるNHNエンドヌクレアーゼドメインを欠いており、代わりに連続DNA切断にRuvC様ドメインに依存しているため、ずれた末端が生成されます。[ 4 ] Cas9とは異なり、Cas12aは独自のジンクフィンガー様ドメインを持ち、DNA結合または構造安定性に寄与している可能性があります。 Cas12aがCas9に勝る重要な利点は、WEDドメイン内に固有のRNase活性があり、前駆体crRNA（pre-crRNA）を成熟crRNAに自己処理できることです。[ 10 ]これにより、トランス活性化crRNA（tracrRNA）の必要性がなくなり、ガイドRNAの設計が簡素化され、複数のcrRNAを単一のベクターにパッケージングすることでマルチプレックス編集が容易になります。

多重ゲノム編集

マルチプレックスゲノム編集は、複数の遺伝子を同時に編集できる強力な技術です。Cas12aは、Cas9と比較して適用が簡素化されているため、この分野で特に有用です。[ 11 ]例えば、Cas12aは、遺伝子を標的として編集するために、短いCRISPR RNA（crRNA）のみを必要とします。[ 12 ] これらのcrRNAは、単一の送達システムにまとめてパッケージ化することで容易にマルチプレックス化することができ、複数のゲノム遺伝子座の同時編集が可能になります。[ 13 ]

さらに、Cas12aとCas9は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の要件にも違いがあります。Cas9は通常、Gに富む配列を探すのに対し、Cas12aはTに富む配列を標的とします。この違いにより、標的とできるゲノム部位の範囲が広がり、Cas12aは植物ゲノムに広く見られるATに富む領域など、Cas9では効率が悪い可能性のある領域でも遺伝子編集が可能になり、[ 14 ]研究者にとってより柔軟な編集が可能になります。

Cas12a は、Cas9 に必要な tracrRNA などの追加コンポーネントを必要とせずに独自の crRNA (CRISPR RNA) を送達できるため、多重編集用のガイド RNA の設計と送達がさらに簡素化されます。

説明

発見

CRISPR-Cas12aは、公開されている細菌遺伝子配列データベースから有望なDNA断片を検索することで発見されました。バイオインフォマティクスによるCRISPRシステムタンパク質としての同定、命名、そして検出のための隠れマルコフモデル（HMM）は、2012年にTIGRFAMsタンパク質ファミリーデータベースのリリースで提供されました。Cas12aは多くの細菌種に存在します。ゲノム編集ツールとして開発された最終的なCas12aエンドヌクレアーゼは、それを保持することが最初に知られた16種のうちの1種から採取されました。[ 15 ]アシダミノコッカスとラクノスピラ科由来の2つの候補酵素は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を示します。[ 3 ]

分類

CRISPR-Casシステムは2つのクラスに分けられます。クラスIでは複数のCasタンパク質がcrRNAと結合して機能的なエンドヌクレアーゼを構築し、クラスIIでは単一のCasエンドヌクレアーゼがcrRNAと結合します。クラスIIはさらにタイプII、タイプV、タイプVIシステムに分けられます。Cas12aはクラスII、タイプVのCRISPR-Casシステムとして同定されています。[ 16 ]

ネーミング

CRISPR（ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）の頭字語は、細菌および古細菌に見られるCasタンパク質とそのcrRNAをコードする不変DNA配列を指します。Cas12aは当初、CRISPRの略称であるCpf1と、それが出現する細菌属であるPrevotellaおよびFrancisellaにちなんで知られていました。2015年に、 Cas （ CRISPR関連）タンパク質の名称を配列相同性に対応するようにより広範に合理化した後、改名されました。[ 16 ]

構造

Cas12aタンパク質には、混合アルファ/ベータドメイン、 Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメイン（2つの非連続セグメント、RuvC-IとRuvC-IIに分割）、およびジンクフィンガー様ドメインが含まれています。[ 17 ] Cas9とは異なり、Cas12aにはHNHエンドヌクレアーゼドメインがなく、Cas12aのN末端領域にはCas9に見られるようなアルファヘリカル認識ローブがありません。[ 16 ]

Cas12a遺伝子座は、Cas1、Cas2、Cas4タンパク質をコードしており、これらはII型よりもI型およびIII型に類似している。データベース検索によると、多くの細菌種にCas12aファミリータンパク質が豊富に存在することが示唆されている。[ 16 ]

また、Cas9とは異なり、Cas12aはtracrRNA（天然のCRISPRシステムではCasタンパク質に結合する前に別のcrRNAと塩基対を形成する必要がある）を必要とせず、代わりに単一のcrRNAに結合する。Cas12aとそのガイドRNAはどちらもCas9システムのタンパク質およびRNA構成要素よりも小さく、Cas12aのcrRNAはCas9で使用されるsgRNAの約半分の長さである。[ 18 ]この小型化により、Cas12aは、カプシドが小さいためDNAパッケージング容量が限られているアデノ随伴ウイルス（AAV）を介した生体内送達などの用途により適している。

Cas12a-crRNA複合体は、Cas9が標的とするGに富むPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）5'-YTN-3' [ 19 ]（ここで「Y」はピリミジン[ 20 ] 、 「N」は任意の核酸塩基）を同定することで標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cas12aは4または5ヌクレオチドのオーバーハングからなる粘着末端様DNA二本鎖切断を導入する。[ 17 ]

機構

CRISPR-Cas12aシステムは、Cas12a酵素と、標的DNAを切断するために二重らせん構造上の正しい位置に複合体を配置するガイドRNAで構成されています。CRISPR-Cas12aシステムの活性には3つの段階があります。[ 15 ]

  • 適応: Cas1 および Cas2 タンパク質は、DNA の小さな断片を CRISPR アレイに適応させることを促進します。
  • crRNA の形成: pre-cr-RNA の処理により、Cas タンパク質を誘導する成熟 crRNA が生成されます。
  • 干渉：Cas12aはcrRNAに結合して二元複合体を形成し、標的DNA配列を識別・切断する。crRNA-Cas12a複合体は、dsDNA中の3～6塩基の5'プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を検索する。PAMが見つかると、タンパク質はdsDNAを局所的に変性させ、crRNAスペーサーとssDNAプロトスペーサー間の相補性を探す。十分な相補性があればRuvCの活性が誘導され、RuvC活性部位は非標的鎖を切断し、続いて標的鎖を切断することで、最終的に5' ssDNAオーバーハング（シス切断）を伴う段差dsDNA切断が生じる。[ 17 ] [ 21 ]

Cas9とCas12a

Cas12aおよびCas9ヌクレアーゼとそれらのDNA切断位置

Cas9はDNAを切断するのに2つのRNA分子を必要とするが、Cas12aは1つしか必要としない。また、これらのタンパク質はDNAを異なる場所で切断するため、研究者は編集部位を選択する際により多くの選択肢を得ることができる。Cas9はDNA分子の両方の鎖を同じ位置で切断し、平滑末端を残す。Cas12aは一方の鎖をもう一方よりも長く残し、粘着末端を作成する。粘着末端は、DNAの非相同末端結合または相同修復において平滑末端とは異なる特性を持つため、遺伝子挿入を試みる際にはCas9よりもCas12aに一定の利点がある。[ 15 ] CRISPR-Cas9システムは遺伝子を効率的に無効化できるが、遺伝子を挿入したりノックインを生成したりすることは困難である。[ 2 ] Cas12aはtracrRNAを欠き、Tに富むPAMを利用し、互い違いのDNA DSBを介してDNAを切断する。[ 18 ]

まとめると、Cas12aとCas9システムの重要な違いは、Cas12aでは次の通りである。[ 22 ]

特徴Cas9Cas12a
構造2つのRNAが必要（または1つの融合転写産物（crRNA+tracrRNA=sgRNA）1つのcrRNAが必要
切断機構鈍端カット交互にカットされたエンドカット
切断場所認識部位の近位認識部位から遠位
対象サイトGに富むPAMT-リッチPAM

起源

Cas12エンドヌクレアーゼは、最終的にはIS200/IS605ファミリートランスポゾンのTnpBエンドヌクレアーゼから進化したと考えられます。TnpBはCRISPR免疫システムにまだ「家畜化」されていませんが、オメガRNAテンプレートシステムを用いてRNA誘導切断を行うことができます。[ 23 ]

ツール

CRISPRを用いる場合、標的効率と特異性には、ガイドRNAの設計を含む様々な側面が影響します。ガイドRNAの最適設計のための多くの設計モデルとCRISPR-Casソフトウェアツールが開発されています。これらには、SgRNAデザイナー、CRISPR MultiTargeter、SSFinderなどがあります。[ 24 ]さらに、Cas12aタンパク質を検出するための市販の抗体も利用可能です。[ 25 ]

知的財産

CRISPR-Cas9は知的財産権紛争の対象となっているが、CRISPR-Cas12aには同様の問題はない。[ 3 ]

注記

参考文献

  1. ^ Bhattacharya, Supreet; Agarwal, Ankit; Muniyappa, Kalappa (2024). 「基質特異性の解読により、CRISPR-Cas12aはエンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を持つ二機能性酵素であることが明らかになった」. Journal of Molecular Biology . 436 (10). doi : 10.1016/j.jmb.2024.168550 . PMID  38575054 .
  2. ^ a b「CRISPRベースの遺伝子工学がCasでキックオフ」 Meta Science News、2015年9月29日。2017年10月22日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2016年5月3日閲覧。
  3. ^ a b c d「CRISPRでさえ」。エコノミスト。ISSN 0013-0613 。2016年5月3日閲覧。 
  4. ^ a b c d Rath D, Amlinger L, Rath A, Lundgren M (2015年10月). 「CRISPR-Cas免疫システム：生物学、メカニズム、そして応用」 . Biochimie . 117 : 119–128 . doi : 10.1016/j.biochi.2015.03.025 . PMID 25868999 . 
  5. ^ Redman M, King A, Watson C, King D (2016年8月). 「CRISPR/Cas9とは何か？」 .小児疾患アーカイブ：教育と実践版. 101 (4): 213– 215. doi : 10.1136/archdischild-2016-310459 . PMC 4975809. PMID 27059283 .  
  6. ^ Horvath P, Barrangou R (2010年1月). 「CRISPR/Cas、細菌および古細菌の免疫システム」. Science . 327 (5962): 167– 170. Bibcode : 2010Sci...327..167H . doi : 10.1126/science.11 ​​79555. PMID 20056882 . 
  7. ^ CRISPR-CAS9、TALENS、ZFNS – 遺伝子編集の戦いhttps://www.ptglab.com/news/blog/crispr-cas9-talens-and-zfns-the-battle-in-gene-editing/ 2021年5月25日アーカイブ、Wayback Machineにて
  8. ^ 「プレスリリース：2020年ノーベル化学賞」ノーベル財団。2021年1月15日時点のオリジナルよりアーカイブ。 2020年10月7日閲覧。
  9. ^ Rawat A, Roy M, Jyoti A, Kaushik S, Verma K, Srivastava VK (2021年8月). 「システインプロテアーゼ：遍在する酵素で病原性寄生性原虫と闘う」 . Microbiological Research . 249 126784. doi : 10.1016/j.micres.2021.126784 . PMID 33989978 . 
  10. ^アイザックソン・W (2021). 『コード・ブレーカー：ジェニファー・ダウドナ、遺伝子編集、そして人類の未来』 ニューヨーク：サイモン＆シュスター、p. 73. ISBN 978-1-9821-1585-2. OCLC  1239982737 . 2023年1月14日時点のオリジナルよりアーカイブ。2021年10月20日閲覧。
  11. ^ Barrangou R , van der Oost J (2013). CRISPR-Casシステム：細菌および古細菌におけるRNAを介した適応免疫. ハイデルベルク：シュプリンガー. p. 6. ISBN 978-3-642-34656-9。
  12. ^ Brouns SJ、Jore MM、Lundgren M、Westra ER、Slijkhuis RJ、Snijders AP、Dickman MJ、Makarova KS、Koonin EV、van der Oost J (2008 年 8 月)。「小さな CRISPR RNA が原核生物の抗ウイルス防御を導く」。科学。321 (5891): 960–964。Bibcode : 2008Sci...321..960B。土井：10.1126/science.11​​59689。PMC 5898235。PMID 18703739。  
  13. ^ Ng H, Dean N (2017). 「シングルガイドRNA発現の増加によるカンジダ・アルビカンス」 . mSphere . 2 ( 2 ): e00385–16. doi : 10.1128/mSphere.00385-16 . PMC 5397569. PMID 28435892 .  
  14. ^ Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK (2013年3月). 「CRISPR-Casシステムを用いたゼブラフィッシュにおける効率的なゲノム編集」 . Nature Biotechnology . 31 (3): 227– 229. doi : 10.1038/nbt.2501 . PMC 3686313. PMID 23360964 .  
  15. ^ a b c Ledford H (2015年10月). 「細菌が新たな遺伝子カッターを生み出す」 . Nature . 526 (7571): 17. doi : 10.1038/nature.2015.18432 . PMID 26432219 . 
  16. ^ a b c d Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, et al. (2015年11月). 「CRISPR-Casシステムの進化的分類の最新版」 . Nature Reviews. Microbiology . 13 (11): 722– 736. doi : 10.1038/nrmicro3569 . PMC 5426118. PMID 26411297 .  
  17. ^ a b c Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, et al. (2015年10月). 「Cpf1はクラス2 CRISPR-Casシステムの単一のRNA誘導エンドヌクレアーゼである」 . Cell . 163 (3): 759– 771. doi : 10.1016/j.cell.2015.09.038 . PMC 4638220. PMID 26422227 .  
  18. ^ a b「Cpf1が次世代CRISPRゲノム編集のためにCas9に参入」 epigenie.com 、 2015年9月29日。 2016年5月3日閲覧。
  19. ^ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016年4月). 「CRISPR関連DNA切断酵素Cpf1は前駆体CRISPR RNAも処理する」. Nature . 532 ( 7600): 517– 521. Bibcode : 2016Natur.532..517F . doi : 10.1038/nature17945 . PMID 27096362. S2CID 2271552 .  
  20. ^ 「ヌクレオチドコード、アミノ酸コード、遺伝コード」 KEGG:京都遺伝子ゲノム百科事典. 2014年7月15日. 2016年5月25日閲覧。
  21. ^ Cofsky JC, Karandur D, Huang CJ, Witte IP, Kuriyan J, Doudna JA (2020年6月). 「CRISPR -Cas12aはRループの非対称性を利用して二本鎖切断を形成する」 . eLife . 9. doi : 10.7554/eLife.55143 . PMC 7286691. PMID 32519675 .  
  22. ^ Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, et al. (2016年5月). 「ガイドRNAおよび標的DNAと複合体を形成したCpf1の結晶構造」 . Cell . 165 ( 4): 949– 962. doi : 10.1016/j.cell.2016.04.003 . PMC 4899970. PMID 27114038 .  
  23. ^ Altae-Tran H, Kannan S, Demircioglu FE, Oshiro R, Nety SP, McKay LJ, et al. (2021年10月). 「広範囲に分布するIS200/IS605トランスポゾンファミリーは、多様なプログラム可能なRNA誘導性エンドヌクレアーゼをコードする」 . Science . 374 (6563): 57– 65. Bibcode : 2021Sci...374...57A . doi : 10.1126 /science.abj6856 . PMC 8929163. PMID 34591643 .  
  24. ^ Graham DB, Root DE (2015年11月). 「CRISPR遺伝子編集実験の設計のためのリソース」 . Genome Biology . 16 : 260. doi : 10.1186/s13059-015-0823-x . PMC 4661947. PMID 26612492 .  
  25. ^ 「抗CPF1抗体（GTX133301）| GeneTex」 www.genetex.com . 2020年10月30日閲覧。
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