エピトープマッピング

エピトープマップはMOA情報を提供する
ショットガン変異エピトープマッピングを用いて決定された、エボラ糖タンパク質（GP）に対する抗体の高解像度エピトープマップ。エピトープマップは、作用機序（MOA）を決定するためのデータを提供します。

免疫学において、エピトープマッピングは、標的抗原（通常はタンパク質上）上の抗体の結合部位、すなわちエピトープを実験的に同定するプロセスである。 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]抗体結合部位の同定と特性評価は、新しい治療薬、ワクチン、および診断薬の発見と開発に役立つ。[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]エピトープの特性評価は、抗体の結合メカニズムの解明にも役立ち[ 9 ]、知的財産（特許）保護を強化することもできる。[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]実験的エピトープマッピングデータは、配列および/または構造データに基づいてB細胞エピトープのin silico予測を容易にする堅牢なアルゴリズムに組み込むことができる。[ 13 ]

エピトープは一般的に、線状エピトープと立体構造/不連続エピトープの2つのクラスに分類されます。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成されます。立体構造エピトープは、折り畳まれた3D構造では近接しているものの、タンパク質配列では離れているアミノ酸によって形成されます。立体構造エピトープには線状セグメントが含まれる場合があることに注意してください。B細胞エピトープマッピング研究では、抗原と抗体、特に自己抗体や防御抗体（ワクチンなど）との相互作用の大部分は、不連続エピトープへの結合に依存していることが示唆されています。

抗体の特性評価における重要性

エピトープマッピングは、作用機序に関する情報を提供することで、治療用モノクローナル抗体（mAb）開発の重要な要素です。エピトープマッピングにより、mAbがどのように機能効果を発揮するか（例えば、リガンドの結合を阻害するか、タンパク質を非機能状態に捕捉するなど）を明らかにすることができます。多くの治療用mAbは、タンパク質が本来の状態（適切に折り畳まれた状態）にある場合にのみ存在する立体構造エピトープを標的とするため、エピトープマッピングは困難です。 [ 14 ]エピトープマッピングは、チクングニアウイルス[ 15 ]、デング熱[ 16 ]、エボラウイルス[ 5 ] 、 [ 17 ]、[ 18 ] 、ジカウイルス[ 19 ]などの蔓延している、または致命的なウイルス病原体に対するワクチンの開発に非常に重要であり、長期的な免疫効果をもたらす抗原要素（エピトープ）を決定します。[ 20 ]

膜タンパク質（例：Gタンパク質共役受容体[GPCR]）[ 21 ]や多サブユニットタンパク質（例：イオンチャネル）などの複雑な標的抗原は、創薬の重要なターゲットです。これらのターゲット上のエピトープのマッピングは、複雑なタンパク質の発現と精製の難しさから困難な場合があります。膜タンパク質は、脂質二重層内でのみ正しく折り畳まれる短い抗原領域（エピトープ）を持つことがよくあります。その結果、これらの膜タンパク質上のmAbエピトープはしばしば立体構造に左右され、マッピングがより困難になります。[ 14 ] [ 21 ]

知的財産（IP）保護の重要性

エピトープマップはIPをサポートする
HER2に対する抗体のショットガン変異誘発エピトープマッピングにより、新規エピトープ（オレンジ色の球体）が明らかになりました。エピトープマップは、知的財産（特許）請求の裏付けデータとなります。

エピトープマッピングは、治療用mAbの知的財産（IP）を保護する上で普及している。抗体の特異的結合部位に関する知識は、現在の抗体と先行技術（既存）の抗体を区別することで、特許や規制申請の強化につながる。 [ 10 ] [ 11 ] [ 22 ]抗体を区別する能力は、複数の競合抗体によって阻害される可能性のある、十分に検証された治療標的（ PD1やCD20など）に対する抗体の特許取得において特に重要である。 [ 23 ]抗体の特許性を検証することに加えて、エピトープマッピングデータは、米国特許商標庁に提出された広範な抗体クレームを裏付けるためにも使用されている。[ 11 ] [ 12 ]

エピトープデータは、治療用抗体が標的とする特定のタンパク質領域をめぐる紛争を含むいくつかの注目を集めた訴訟で中心的な役割を果たしてきた。[ 22 ]この点において、アムジェン対サノフィ/リジェネロン・ファーマシューティカルズ社のPCSK9阻害剤訴訟は、アムジェン社とサノフィ/リジェネロン社の両方の治療用抗体がPCSK9の表面上の重複するアミノ酸に結合することを示すことができるかどうかにかかっていた。[ 24 ]

方法

標的抗原上の抗体エピトープをマッピングする方法はいくつかあります。

  • X線共結晶構造解析と極低温電子顕微鏡（クライオ電子顕微鏡）。X線共結晶構造解析は、抗原と抗体の相互作用を直接可視化できるため、歴史的にエピトープマッピングのゴールドスタンダードとみなされてきました。クライオ電子顕微鏡も同様に、抗体-抗原相互作用の高解像度マップを提供できます。 [ 25 ]しかし、どちらの手法も技術的に困難で、時間がかかり、高価であり、すべてのタンパク質が結晶化に適しているわけではありません。さらに、これらの手法は、正しく折り畳まれ、処理されたタンパク質を十分な量入手することが困難なため、必ずしも実現可能ではありません。最後に、どちらの手法も、同じアミノ酸群に結合するmAbの重要なエピトープ残基（エネルギー的に「ホットスポット」）を区別することはできません。 [ 26 ]
  • アレイベースのオリゴペプチドスキャン。オーバーラップペプチドスキャンまたはペプスキャン分析としても知られるこの技術は、標的タンパク質のオーバーラップする部分とオーバーラップしない部分のオリゴペプチド配列のライブラリを使用し、対象の抗体への結合能力を試験する。この方法は迅速で、比較的安価であり、特定の標的に対する多数の候補抗体のエピトープのプロファイルに特に適している。 [ 20 ] [ 27 ]エピトープマッピングの解像度は、使用するオーバーラップペプチドの数に依存する。このアプローチの主な欠点は、不連続なエピトープがより小さなペプチドに分解され、結合親和性が低下する可能性があることである。しかし、不連続なエピトープだけでなく立体構造のエピトープも模倣できる制約ペプチドなどの技術の進歩があった。例えば、ある研究[ 28 ]では、 CD20に対する抗体がアレイベースのオリゴペプチドスキャンを用いてマッピングされました。このスキャンでは、標的タンパク質の異なる部位から非隣接ペプチド配列を組み合わせ、この組み合わせたペプチドにコンフォメーションの剛性を付与します（例えば、CLIPSスキャフォールド[ 29 ]を使用）。ペプチドの置換解析では、単一のアミノ酸の分解能も可能であり、重要なエピトープ残基を正確に特定することができます。
  • 部位特異的変異誘発マッピング。分子生物学的手法である部位特異的変異誘発（SDM）は、エピトープマッピングを可能にする。SDMでは、標的タンパク質の配列にアミノ酸の系統的変異を導入する。変異した各タンパク質への抗体の結合を試験することで、エピトープを構成するアミノ酸を同定する。この手法は、線状エピトープと立体構造エピトープの両方のマッピングに使用できるが、労力と時間がかかり、通常、分析対象は少数のアミノ酸残基に限定される。 [ 2 ]
  • ハイスループットショットガン突然変異誘発エピトープマッピング。[ 2 ] [ 10 ] [ 30 ]ショットガン突然変異誘発は、mAbsのエピトープをマッピングするためのハイスループットアプローチです。[ 30 ]ショットガン突然変異誘発技術は、各クローンが固有のアミノ酸変異（通常はアラニン置換）を含む、標的抗原全体の突然変異ライブラリの作成から始まります。ライブラリからの数百のプラスミドクローンが384ウェルマイクロプレートに個別に並べられ、ヒト細胞で発現され、抗体結合についてテストされます。抗体結合に必要な標的のアミノ酸は、免疫反応性の喪失によって識別されます。これらの残基は、エピトープを視覚化するために標的タンパク質の構造にマッピングされます。ハイスループットショットガン変異誘発エピトープマッピングの利点としては、1) 線状エピトープと立体構造エピトープの両方を同定できること、2) 他の方法よりもアッセイ時間が短いこと、3) 適切に折り畳まれ、翻訳後修飾されたタンパク質が提示されること、4) エネルギー相互作用を駆動する重要なアミノ酸（エピトープのエネルギー「ホットスポット」）を同定できることなどが挙げられます。[ 26 ] [ 31 ]しかし、ほとんどの治療用抗体の場合のように、結合に大きな界面が関与する立体構造エピトープの場合、1つの残基の変異が必ずしも全体の結合親和性の明らかな変化をもたらすわけではありません。これらのエピトープ残基は、この方法では見逃される可能性があります。
  • 水素–重水素交換（HDX）。この方法は、抗原と抗体のさまざまな部分の溶媒アクセシビリティに関する情報を提供し、タンパク質間相互作用領域での溶媒アクセシビリティの低下を実証します。 [ 32 ]この方法の利点の1つは、抗原抗体複合体の相互作用部位をそのネイティブ溶液で決定し、抗原または抗体のどちらにも変更（例：変異）を導入しないことです。HDXエピトープマッピングは、エピトープ構造の完全な情報を迅速に提供する効果的な方法であることも実証されています。 [ 33 ]従来のボトムアップHDX-MSアプローチでは通常、アミノ酸レベルのデータが得られませんが、この制限は、新しいミドルダウンアプローチを使用したHDX FineMappingによって克服されました。 [ 34 ] PD1上のペンブロリズマブ（キイトルーダ）の結合エピトープは、この方法によって1アミノ酸分解能で決定され（ https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.05.02.592265v1 ）、X線結晶構造解析に匹敵する分解能を達成しました。この方法は、インフルエンザヘマグルチニンという複雑なタンパク質系を例に挙げ、迅速かつ費用対効果の高いエピトープマッピング手法として最近推奨されています[ 35 ] 。
  • 架橋結合質量分析法。[ 36 ]抗体と抗原は標識架橋剤に結合し、複合体の形成は高質量MALDI検出によって確認される。その後、抗体と抗原の結合位置は質量分析法（MS）によって特定できる。架橋複合体は非常に安定しており、さまざまな酵素および消化条件にさらすことができるため、さまざまなペプチドの検出オプションが可能になる。MSまたはMS/MS技術を使用して、標識架橋剤と結合ペプチドのアミノ酸位置を検出する（エピトープとパラトープの両方を1回の実験で決定する）。この技術の主な利点は、MS検出の高感度であることで、必要な材料はごくわずか（数百マイクログラム以下）である。

酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ[ 37 ]、限定タンパク質分解などの他の方法は、抗体結合のハイスループットモニタリングを提供しますが、特にコンフォメーションエピトープの分解能が不足しています。[ 38 ]

参照

参考文献

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