ミケ

定量的リアルタイムPCR実験の発表のための最小限の情報（MIQE ）ガイドラインは、定量的リアルタイムPCR実験とデータを実施および報告するための一連のプロトコルであり、2009年にStephen Bustin、Michael Pfaffl、Mikael Kubistaと同僚によって考案されました。 [ 1 ]これらのガイドラインは、RT-qPCRを用いて自閉症児の麻疹ウイルスを検出したと主張する論文が2002年に発表された後に考案されましたが、その結果は他の科学者によって完全に再現不可能であることが判明しました。[ 2 ]著者自身もそれを再現しようとせず、生データには大量のエラーと分析の基本的な間違いがあることがわかりました。この事件がきっかけで、Stephen Bustinは科学文献に発表されるqPCRデータのベースライン品質レベルを提供するためにMIQEガイドラインを作成しました。[ 2 ]

目的

MIQEガイドラインは、当時学術誌に投稿されたqPCRデータの質の低さを理由に作成されました。次世代シーケンシング機器の登場により、qPCR実験のコスト削減が可能になり、qPCRデータの質はますます高くなっていました。この技術は科学のあらゆる分野で利用されているため、qPCRの機器、方法、設計は大きく異なります。全体的な質の向上を図るため、MIQEガイドラインは、他の研究者が出版された資料を読む際に理解し活用するための最低限の報告情報として収集すべき基本的な実験手順とデータ形式に関する一般的な提案として作成されました。このような広く認知され、広く合意されたガイドラインを策定することは、特に開発途上国から様々な言語やプロトコルで提供される科学研究の量がますます増加していることから、科学界にとって重要であると考えられました。[ 3 ]

歴史

オリジナル版の開発

2009年、スティーブン・バスティンは、ミカエル・クビスタ教授とマイケル・ファッフル教授を含む国際的な科学者グループを率いて、qPCRの実施方法と、その過程でどのような形式のデータを収集・出版すべきかに関するガイドラインをまとめました。[ 1 ]これにより、科学雑誌の編集者や査読者は、qPCRデータを含む投稿論文を審査する際に、これらのガイドラインを活用できるようになりました。つまり、これらのガイドラインは、手順の各ステップにおける一種のチェックリストとして作成され、特定の項目は出版用データ提出時に必須（E）とマークされ、他の項目は望ましい（D）とマークされました。[ 4 ]

2010年9月には、蛍光ベースの定量的リアルタイムPCR用のガイドラインの追加版が公開されました。これは、より広範なガイドラインの要約としても機能しました。 [ 5 ]他の研究者は、シングルセルqPCR [ 6 ]やデジタルPCR（dPCR）など、追加または異なる項目の確認が必要となる可能性のある特定のqPCR向けに、さらなるバージョンを作成しています。 [ 7 ]既存のMIQEガイドラインの適切な遵守については、光バイオモジュレーション[ 8 ]や臨床バイオマーカーなど、他の科学分野でも概説されています。[ 9 ]

2014年にバスティンは（そして2017年に再び）科学界でMIQEガイドラインがある程度取り入れられ、使用されているものの、最も基本的なデータ提示やそのデータの有効性の適切な確認さえ欠如しているqPCR実験に関する発表論文が依然としてあまりにも多すぎると指摘した。これらの研究は再現性に関する重大な問題を抱えており、その証拠に基づく結論は他の研究者によって再現できず、当初の結果に疑問が生じていた。これはすべて、多くの論文がバスティンのオリジナルのMIQE出版物を直接引用しながらも、自身の実験で材料のガイドラインチェックリストに従っていないにもかかわらず起こったことだった。[ 2 ] [ 10 ]しかし、一部の研究者は少なくともある程度の成功を指摘しており、MIQEチェックリストに合格しなかったために学術雑誌に多数の論文が掲載されなかった。他の研究は、MIQEガイドラインを満たす適切なデータが不足していることが指摘され、雑誌編集者に公に指摘された後、事後に撤回されている。[ 11 ]

ガイドラインの強化

ニューイングランド・バイオラボは、2017年に「Dots in Boxes」と題した新しい比較qPCRシステムを構築した際、データがプロトコルのすべての最小パラメータチェックリストに適合するように、MIQEガイドラインに基づいてデータ収集部分を設計したと述べています。[ 12 ]他の科学機器メーカーも、ガイドライン遵守を支援するために、意図的にデバイスをカスタマイズしています。例えば、バイオ・ラッドは、各ステップの完了時にMIQEチェックリストをアクティブにマークできるモバイルアプリを開発しました。 [ 13 ]

2020年6月には、MIQEガイドライン発行10周年を振り返る調査が行われ、ガイドラインに従うことでより優れた、より体系的な結果が得られた科学的研究について議論された。[ 14 ] 2020年8月には、2013年の最初のリリース以降の機械、技術、手法の改善を考慮して、デジタルPCR法のガイドラインの更新版が発行された。データ分析のためのガイドライン手順が追加され、研究者が使用できるように簡素化されたチェックリスト表も提供された。[ 15 ] 2020年12月には、スティーブン・バスティンと共同で、COVID-19パンデミック中にCOVID-19ウイルス粒子の臨床的存在を特定するために、臨床バイオマーカー向けのMIQEガイドラインを使用してRT-qPCRターゲティングアッセイが開発された。[ 16 ]

ガイドラインの概要

MIQEガイドラインは9つのセクションに分かれており、チェックリストを構成しています。これらのセクションには、qPCR自体の実施に関する考慮事項だけでなく、得られたデータの収集、分析、および提示方法も含まれています。特に重要なのは、使用した解析ソフトウェアに関する情報と、生データを関連データベースに送信することです。[ 1 ]

実験デザイン

ガイドラインの大部分には、実験群と対照群の違いを説明する項目など、実験や出版物に通常含まれる基本的な手順が含まれています。その他の情報としては、実験において各群で使用されたユニット数などがあります。これら2つの項目は、あらゆる研究に不可欠であると定義されています。このセクションには、著者の研究室自体がqPCRアッセイを実施したのか、それとも大学や組織の中核研究室が実施したのかを明記すること、そして研究に貢献した他の個人への謝辞という、2つの望ましい点も含まれています。[ 1 ]

サンプル

サンプルおよびサンプル材料が満たさなければならない必須要件には、サンプルの説明、使用された解剖方法、処理方法、サンプルが凍結または固定されたかどうか、またその処理に要した時間、そしてどのようなサンプル条件が用いられたかが含まれます。また、qPCRのために処理されたサンプルの体積または質量を知ることも望ましいです。[ 1 ]

核酸抽出

DNA/RNA抽出プロセスには、いくつかの重要なガイドラインがあります。これには、行われた抽出プロセスの説明、使用されたDNA抽出キットとその手順の変更に関する記述、DNaseまたはRNase処理が使用されたかどうかの詳細、汚染が評価されたかどうかに関する記述、抽出された遺伝物質の量の定量、抽出に使用された器具の説明、RNAの完全性を維持するために使用された方法、RNAの完全性番号と品質指標、および到達した定量サイクル（Cq）に関する記述、そして最後に、阻害物質の有無を判断するために行われた試験が含まれます。必要な情報は、使用した試薬の入手先、得られた遺伝学的純度のレベル、得られた収量、および確認のための電気泳動ゲル画像です。[ 1 ]

逆転写

この段階では、反応条件の詳細、使用したRNA量と反応液量、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドとその濃度、使用した逆転写酵素の濃度と種類、そして反応温度と反応時間について詳細に記載することが不可欠です。また、使用した試薬のカタログ番号とメーカー、転写酵素の有無によるCqの標準偏差、そしてcDNAの保存方法も記載することが望ましいです。[ 1 ]

qPCRターゲット情報

標的に関するすべての基本情報はここに必要です。これには、遺伝子記号、対象配列のアクセッションデータベース番号、増幅される配列の長さ、BLASTなどの特異性スクリーニングに関する情報、配列に存在するスプライシングバリアント、各プライマーのエクソンまたはイントロンの位置などが含まれます。このセクションには、アンプリコンの位置、擬似遺伝子または相同遺伝子の存在の有無、配列アライメントの有無とそこから得られたデータ、増幅された配列の二次構造に関するデータなど、必須ではない情報もいくつかあります。 [ 1 ]

qPCRオリゴヌクレオチド

オリゴヌクレオチドの作成に必要な必須情報は、使用したプライマー配列と、配列に加えられた変更箇所と詳細の2点のみです。しかし、RTPrimerDBデータベースの識別番号、プローブの配列、オリゴヌクレオチドの製造元、精製方法など、さらに重要なデータもいくつかあります。[ 1 ]

qPCRプロトコル

ガイドラインの主要なセグメントの一つとして、qPCRプロセス自体のチェックリストにはいくつかの重要な部分があります。これには、反応に使用されたすべての条件、反応とcDNAの両方の量、プローブ、マグネシウムイオン、dNTPの濃度、使用されたポリメラーゼの種類とその濃度、使用されたキットとそのメーカー、反応に使用された添加剤、qPCR装置の製造元、およびサーモサイクリングプロセスに設定されたパラメータが含まれます。必要な追加情報は、使用されたバッファーの化学組成、使用されたプレートとチューブの製造元とそのカタログ番号、および反応が手動でセットアップされたか機械でセットアップされたかのみです。[ 1 ] [ 17 ]

qPCR検証

実施されたqPCRプロセスの有効性と品質を確認するためには、いくつかの手順とそれに伴うデータを提示する必要があります。これには、ゲルの使用、遺伝物質の直接シーケンシング、融解プロファイルの提示、制限酵素による消化など、プロセスが機能したことを確認するための具体的な方法の説明が含まれます。SYBR Green Iを使用した場合は、テンプレートDNAを含まない対照群のCqを示す必要があります。[ 1 ]

さらに重要なデータには、傾きと y 切片を記録した機械曲線の較正、前述の傾きから決定した PCR プロセスの効率、較正曲線の相関係数 (r の二乗)、直線曲線のダイナミック レンジ、結果の 95% が依然として陽性であった最低濃度で見つかった Cq ( LOD ) と LOD 自体の証拠、そして最後に、マルチプレックスを使用する場合は、実行した各アッセイの効率と LOD を示す必要があります。[ 1 ] [ 17 ] LOD の決定に加えて、診断アッセイではISO標準に従って、医薬品開発では Hays らによる AAPS ホワイト ペーパーの推奨事項に従って、定量限界(LOQ) も決定する必要があります。[ 18 ]これらの計算は、標準曲線の反復分析に基づいています。[ 19 ]

追加の望ましい情報には、勾配の使用によってqPCRの最適化が行われたことを示す証拠、 qPCRの効率を示す信頼区間、およびテストされた範囲全体の信頼区間が含まれます。[ 1 ]

データ分析

ガイドラインの最終セクションでは、qPCRデータの解析方法に関する情報が記載されています。その重要な部分には、解析に使用されたプログラムとそのバージョン、Cqの決定方法、データ内の外れ値ポイントの特定方法とその使用方法または除外方法、鋳型遺伝物質を含まない対照群で得られた結果、使用された参照遺伝子の選択理由とその数の説明、データの正規化に使用された方法、含まれた技術的反復の数、アッセイ内のデータの再現性、結果の有意性を判断するために使用された方法、そして定性分析のこの部分に使用されたソフトウェアが含まれます。[ 1 ]

また、生物学的反復の数とそれらが技術的反復の結果と一致したかどうか、濃度変異体の再現性データ、検出力分析のデータに関する情報を含めることが望ましく、最後に研究者は生データをRDMLファイル形式で提出する必要がある。[ 1 ] [ 20 ]

参考文献

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