スパイキャッチャー

SpyTag /SpyCatcherシステムは、組み換えタンパク質を不可逆的に結合させる技術です。ペプチドSpyTag（13アミノ酸）は、タンパク質SpyCatcher（12.3 kDa）と自発的に反応し、両者の間に分子間イソペプチド結合を形成します。 [ 1 ] SpyTagまたはSpyCatcherをコードするDNA配列を、目的のタンパク質をコードするDNA配列に組み換え的に導入することで、融合タンパク質を形成できます。これらの融合タンパク質は、SpyTag/SpyCatcherシステムを介して反応中に混合することで 共有結合的に結合します。

タグ/キャッチャーペアを用いることで、従来の2つのタンパク質間の直接的な遺伝子融合では困難あるいは不可能であった、2つの組換えタンパク質間のバイオコンジュゲーションを実現できます。例えば、タンパク質のフォールディング、発現宿主の最適化不足、特殊な翻訳後修飾といった問題は、タグ/キャッチャーシステムのモジュール性によってタンパク質の生産を分離することで軽減される可能性があります。[ 2 ]

発達と反応メカニズム

SpyTagとSpyCatcherは、 Streptococcus pyogenes由来のFbaBタンパク質のCnaB2ドメインを分割および改変して形成されました。このドメインは、自然に分子内イソペプチド結合を形成し、宿主細胞のコロニー形成を助けます。[ 3 ] [ 4 ]イソペプチド結合の形成により、CnaB2ドメインは構造、熱、pHの変化に対してより耐性を持つようになります。

これを基に、D556の反応性アスパラギン酸を含むC末端β鎖を抽出し、反応性リジンK470と触媒グルタミン酸E516を含む残りのβ鎖を残してSpyCatcherとし、さらにいくつかの疎水性表面残基を除去するエンジニアリングを行った後、SpyTagがCnaB2から得られた。得られたSpyTag/SpyCatcherは、1.4 ± 0.4 × 10 3 M −1 s −1の二次速度定数でイソペプチド結合を形成することができる。反応機構は、E516を介したK470からのD556への求核攻撃によって進行すると仮定されている[ 5 ] 。 [ 6 ] SpyTag:SpyCatcherを再構成することにより、得られた共役複合体は親CnaB2ドメインの安定性を獲得する。

第二世代のSpyTag/SpyCatcherであるSpyTag002/SpyCatcher002は、ファージディスプレイによって作成され、ペプチド-タンパク質ペアが元のペアよりも最大12倍速く反応することを可能にし、速度定数は2.0 ± 0.2 × 10 4 M −1 s −1です。[ 7 ]第二世代のSpyCatcher002は、SpyCatcherに存在する自己反応性も排除しています。[ 7 ]

第三世代のSpyTag/SpyCatcherであるSpyTag003/SpyCatcher003も、合理的な設計により作製されました。この試薬は、反応速度定数5.5 ± 0.6 × 10 5 M −1 s −1で、元の試薬と比較して最大400倍の速度で反応します。[ 8 ]この試薬は、以前の2世代のSpyTag/SpyCatcher試薬と反応します。[ 8 ]

SpyTag/SpyCatcherは、細菌や哺乳類細胞が存在する環境下でも特異的に反応します。[ 1 ] [ 7 ] [ 8 ]

アプリケーション

SpyTag/SpyCatcher結合システムは、その特異性、不可逆的な共有結合、遺伝子のエンコード可能性により、様々な用途に利用されています。[ 5 ] [ 9 ] [ 10 ]

ワクチン生産

SpyTagまたはSpyCatcherのいずれかをウイルス様粒子などの自己組織化分子に融合させることで、もう一方のペアに融合した抗原を、形成されたイソペプチド結合を介して分子上に装飾することができる。[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]これにより、中心となる自己組織化分子を事前に貯蔵しておくことができ、抗原は適切なタンパク質折り畳みを実現するのに最適な条件下で簡単に製造できるため、ワクチンの迅速な製造が可能となる。

酵素環化

タンパク質のN末端とC末端を融合させた酵素の環化は、酵素の熱安定性を高めるのに役立ちます。SpyTagとSpyCatcherを酵素の末端に共存させることで、酵素はイソペプチド結合を形成し、自発的に環化します。環化されたβ-ラクタマーゼ、フィターゼ、ホタルルシフェラーゼ、キシラナーゼは、冷却後、さらには100℃の加熱後でも酵素活性を維持することが示されています。 [ 15 ] [ 16 ]

タンパク質ハイドロゲル

ハイドロゲルは、生物医学科学において幅広い応用が期待されています。ハイドロゲルの原料として一般的に用いられるものの一つは、エラスチン様ポリペプチドです。SpyTag/SpyCatcher化学は、これらのハイドロゲル内にカスタマイズされた分子ネットワーク（「スパイのネットワーク」）を構築するために用いられ、線維芽細胞などの生きた哺乳類細胞を包み込むことを可能にしました。[ 17 ]その後の改良により、光応答性ハイドロゲルの形成、[ 18 ]細胞と材料の相互作用をユーザー定義で制御すること、[ 19 ]ヒアルロン酸とエラスチン様ポリペプチドの複合、 [ 20 ]酵素フロー生体触媒のためのタンパク質足場の作成などが可能になりました。[ 21 ]

拡張タグ/キャッチャーペア

SpyTag/SpyCatcherが開発される前は、 Streptococcus pyogenesのタンパク質Spy0128からIsopeptag/Pilin-Cのペアが作られていました。[ 22 ] SpyTag/SpyCatcherに続いて、 SpyTag /SpyCatcherとは交差反応性のないStreptococcus pneumoniaeのRrgAタンパク質から、完全に直交するペアであるSnoopTag/SnoopCatcherが開発されました。 [ 23 ] SnoopTag/SnoopCatcherは、SpyTag/SpyCatcherにあるLys-Aspの代わりにLys-Asnの間にイソペプチド結合を形成することに注意してください。RrgAの同じドメインが、SnoopTag/SnoopCatcherを作成するために使用されたものとは異なる方法で分割され、新しいペアはDogTag/DogCatcherと呼ばれています。伸長構造を持つSpyTagやSnoopTagとは異なり、DogTagを作成するために使用されるRrgA領域はβヘアピンを形成するため、タンパク質ループへの挿入が容易です。この特性は、哺乳類TRPC5膜チャネルタンパク質の内部ループを蛍光標識することに成功しています。このループはタンパク質末端を修飾することができないため、TRPC5のチャネル特性に影響を与えません。[ 24 ] DogTagは、可溶性タンパク質（スーパーフォルダーGFP、HaloTag、Gre2p）に挿入することで、DogCatcherとの結合に成功しています。 [ 24 ]

SdyTag/SdyCatcherのペアも同年にStreptococcus dysgalactiaeのフィブロネクチン結合タンパク質CnaBドメインから開発されましたが、このタンパク質はSpyTag/SpyCatcherの由来となった親タンパク質と配列類似性を持っているため、SdyTag/SdyCatcherはSpyTag/SpyCatcherと交差反応性があります。[ 25 ]

異なる種から相同なタンパク質を探すのではなく、最小限の変異でSpyTag/SpyCatcherから新しいタグ/キャッチャーペアが開発されました。SpyTag I3W (A W )はSpyCatcher F77V、F94A (B VA )と反応しますが、SpyCatcherとはほとんど反応しません。一方、SpyCatcher F77V、F94AはSpyTag I3WとSpyTagの両方と反応します。[ 26 ]しかし、SpyCatcher F77V、F94Aと両方のSpyTagバージョンとの交差反応性により、新しいタグ/キャッチャーペアとしての有用性が制限される可能性があります。

タンパク質連結には異なる化学反応を利用することもできる。Clostridium perfringens細胞表面接着タンパク質Cpe0147における分子内エステル結合形成の発見は、Cpe0147 565–587をタグ、Cpe0147 439–563をキャッチャーとする別のタグ/キャッチャーペアの開発につながった。 [ 27 ] Thr-Gln間に形成されるエステル結合は不可逆的であるが、ThrをSerに変異させることにより、Ser-Glnエステル結合はpHの変化によって可逆的となる。

Spy&Goアフィニティー精製

SpyCatcherの触媒グルタミン酸残基（E77）をアラニンに変異させると、イソペプチド結合の形成は停止しますが、初期の非共有結合によるSpyTag/SpyCatcherの会合は妨げられません。この非共有結合によるSpyTag/SpyCatcherの相互作用は、SpyTag融合組換えタンパク質のアフィニティー精製に利用されてきました。[ 28 ] Spy&Goと呼ばれるこの精製戦略では、樹脂に固定化されたSpyCatcherを用いて、細胞培養上清または細胞溶解物からSpyTag融合タンパク質を回収します。非特異的に結合したタンパク質は、樹脂を中性緩衝液で洗浄することで除去され、標的タンパク質は高濃度イミダゾールを用いて中性pHで溶出されます。

Spy&Go アフィニティー樹脂は SpyCatcher2.1 E77A S49C 変異体をベースとし、SpyDock と呼ばれています。[ 28 ] SpyDock は大腸菌で可溶性タンパク質として発現させ、 Ni-NTAおよび陰イオン交換樹脂を使用して精製し、S49C 置換によって導入された不対システインを介してヨードアセチル活性化アガロースに固定化することができます。生理的塩濃度の中性緩衝液中では、SpyDock は SpyTag および SpyTag002 融合タンパク質に高ナノモル範囲の親和性で結合します (SpyTag の場合 K d = 750 ± 50 nM、SpyTag002 の場合 K d = 73 ± 13 nM)。[ 28 ] SpyTag003 への親和性は報告されていませんが、完全に解離するにはより厳しい条件が必要であることから、より強く結合することが示唆されています。[ 8 ] SpyDockに結合したタンパク質は、中性緩衝液中の2.5 Mイミダゾールで樹脂をインキュベートすることによって溶出されます。[ 28 ] SpyDock樹脂は、4 Mイミダゾール、6 Mグアニジニウム塩酸塩、0.1 M NaOHで連続洗浄することで数回再生できます。[ 28 ]

Spy&GoによるN末端、内部、C末端SpyTagのいずれかを用いたタンパク質の精製が報告されている。[ 8 ] [ 28 ] SpyDock樹脂は全てのSpyTag世代（SpyTag、[ 1 ] SpyTag002、[ 7 ] SpyTag003 [ 8 ]）と互換性があり、精製されたタンパク質とSpyCatcherとの共有結合を妨げない。[ 28 ]

参照

参考文献

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