グラム染色

グラム陽性球菌とグラム陰性桿菌の顕微鏡写真。
最も一般的なグラム染色参照細菌である黄色ブドウ球菌（S. aureus ATCC 25923、グラム陽性球菌、紫色）と大腸菌（E. coli ATCC 11775、グラム陰性桿菌、赤色）の混合グラム染色

グラム染色（グラム染色法、グラム法）は、細菌種をグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の2つの大きなグループに分類するために用いられる染色法である。また、真菌感染症の診断にも用いられる。[ 1 ]この名称は、1884年にこの手法を開発したデンマークの細菌学者ハンス・クリスチャン・グラムに由来する。 [ 2 ]

グラム染色は、細胞壁の化学的・物理的性質によって細菌を区別する。グラム陽性細胞は細胞壁に厚いペプチドグリカン層を持ち、主染色剤であるクリスタルバイオレットを保持する。グラム陰性細胞はペプチドグリカン層が薄く、エタノールを加えるとクリスタルバイオレットが洗い流される。グラム陰性細胞は対比染色剤[ 3 ]によってピンクまたは赤に染色される。対比染色剤にはサフラニンまたはフクシンが一般的に用いられる。クリスタルバイオレットを加えた後、必ずルゴールヨウ素溶液を加える。ルゴールヨウ素溶液はクリスタルバイオレットと安定した複合体を形成し、染色剤と細胞壁の結合を強化する。[ 4 ]

グラム染色は、細菌群の同定においてほぼ常に最初のステップとなります。グラム染色は臨床および研究の両面で有用な診断ツールですが、すべての細菌をこの方法で明確に分類できるわけではありません。そのため、グラム染色不確定群とグラム染色不確定群が存在します。

歴史

この染色法は、発明者であるデンマークの科学者ハンス・クリスチャン・グラム（1853-1938）にちなんで名付けられました。グラムは、1884年にベルリン市立病院の遺体安置所でカール・フリードレンダーとともに研究中にこの技法を考案しました。グラムが考案した染色法は、細菌の種類を区別するためではなく、肺組織の染色切片で細菌をより見やすくするために考案されました。[ 5 ]グラムは、細菌細胞の中には脱色に対して顕著な抵抗性を持つものがあることに気づきました。これらの観察に基づいて、グラムは最初のグラム染色法を考案し、最初は脱色にエールリッヒのアニリン-ゲンチアナバイオレット、ルゴールヨウ素、無水アルコール、対比染色にビスマルクブラウンを使用しました。[ 6 ]彼は1884年にこの方法を発表し、その短い報告書の中でチフス菌が染色を保持しないという観察結果を取り上げました。 [ 7 ]グラムは当初、彼の手法ではグラム陰性菌とグラム陽性菌を区別していませんでした。[ 6 ]

用途

膣スワブから採取したカンジダ・アルビカンスのグラム染色。小さな楕円形の厚膜胞子の直径は2～4μm 。

グラム染色は細菌学の実験技術であり[ 8 ]、細胞壁の物理的特性に基づいて細菌種を2つの大きなグループ（グラム陽性とグラム陰性）に区別するために使用されます。[ 9 ]グラム染色は真菌感染症 の診断にも使用できます。[ 1 ]グラム染色は古細菌の分類には使用されません。これらの微生物は、系統群に従わない非常に多様な反応を示すためです。[ 10 ]

グラム染色は、感染が疑われる場合に体液または生検で行われます。グラム染色は培養よりもはるかに迅速に結果が得られるため、感染が患者の治療と予後に大きな影響を与える場合に特に重要です。例えば、髄膜炎の髄液や化膿性関節炎の滑液などが挙げられます。[ 11 ] [ 12 ]

染色メカニズム

紫色に染色されたグラム陽性菌（左）とピンク色に染色されたグラム陰性菌（右）

グラム陽性細菌はペプチドグリカンでできた厚い網目状の細胞壁（細胞膜の50～90%）を持つため、クリスタルバイオレットで紫色に染まります。一方、グラム陰性細菌は細胞壁が薄いため（細胞膜の10%）、紫色の染色は保持されず、サフラニンでピンク色に対比染色されます。グラム染色には4つの基本的なステップがあります。

  1. 加熱固定した細菌培養標本に一次染色（クリスタルバイオレット）を塗布する。加熱固定は一部の細菌を死滅させるが、染色中に細菌が洗い流されないように、主にスライドガラスに固定するために用いられる。
  2. ヨウ素を加えるとクリスタルバイオレットに結合し、細胞内に閉じ込められる。
  3. エタノールまたはアセトンによる急速脱色
  4. サフラニンによる対比染色。[ 13 ]カルボルフクシンは嫌気性細菌をより強く染色するため、サフラニンの代わりに使用されることもありますが、対比染色としてはあまり一般的ではありません。[ 14 ]
グラム染色の概要
の応用試薬セルの色
グラム陽性グラム陰性
一次染料クリスタルバイオレット紫紫
トラッパーヨウ素紫紫
脱色剤アルコール/アセトン紫無色
カウンターステインサフラニン/カルボルフクシン紫ピンクまたは赤

クリスタルバイオレット（CV）は水溶液中でCVに解離する。+および塩化物（Cl−）イオン。これらのイオンはグラム陽性細胞とグラム陰性細胞の両方の細胞壁を透過します。CV+イオンは細菌細胞の負に帯電した成分と相互作用し、細胞を紫色に染めます。[ 15 ]

ヨウ化物（I−あるいは私− 3）はCVと相互作用する+細胞の内層と外層にクリスタルバイオレットとヨウ素（CV-I）の大きな複合体を形成する。ヨウ素はしばしば媒染剤と呼ばれるが、実際にはCV-I複合体の除去を防ぐ捕捉剤であり、細胞を着色する。[ 16 ]

アルコールやアセトンなどの脱色剤を加えると、細胞膜の脂質と相互作用します。[ 17 ]グラム陰性細胞は外側のリポ多糖膜を失い、内側のペプチドグリカン層が露出します。CV-I複合体は外膜とともにグラム陰性細胞から洗い流されます。[ 18 ]対照的に、グラム陽性細胞はエタノール処理によって脱水されます。大きなCV-I複合体は、ペプチドグリカンの多層構造のためにグラム陽性細胞内に閉じ込められます。[ 18 ]脱色ステップは非常に重要であり、適切なタイミングで行う必要があります。脱色剤を長時間（数秒程度）放置すると、グラム陽性細胞とグラム陰性細胞の両方からクリスタルバイオレット染色が除去されてしまいます。[ 19 ]

脱色後、グラム陽性菌は紫色のままで、グラム陰性菌は紫色を失います。[ 19 ]対比染色は通常、正に帯電したサフラニンまたは塩基性フクシンで、最後に塗布することで脱色されたグラム陰性菌をピンク色または赤色に染めます。[ 3 ] [ 20 ]グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方が対比染色をします。しかし、グラム陽性菌ではクリスタルバイオレット染色がより濃いため、対比染色は見えません。

例

グラム陽性細菌

膿細胞に囲まれたグラム陽性連鎖球菌のグラム染色

グラム陽性細菌は一般的に、厚いペプチドグリカンに囲まれた単層膜（単皮細胞）を有する。この規則は、バシロ門（モリクテス綱とネガティビクテス綱を除く）と放線菌門の2つの門にも当てはまる。[ 9 ] [ 21 ]対照的に、クロロフレクソタ門（緑色非硫黄細菌）は単皮細胞であるが、ペプチドグリカンが薄いか、あるいはペプチドグリカンを欠いており（デハロコッコイデス綱）、染色結果は陰性、陽性、または不確定である。デイノコッコタ門は陽性染色を示すが、厚いペプチドグリカンを持つ二層細胞である。[ 9 ] [ 21 ]

細胞壁の強度は、ペプチドグリカンに埋め込まれた糖鎖物質であるテイコ酸によって高められています。テイコ酸は、細胞の正味の負電荷を生成する、細胞壁の剛性と形状維持に寄与する、細胞分裂を助け、熱や塩分などの様々なストレス因子に対する抵抗力を高めるなど、複数の役割を果たしています。ペプチドグリカン層は高密度であるにもかかわらず、比較的多孔質であるため、ほとんどの物質が透過できます。グラム陽性細菌は、より大きな栄養素を得るために、細胞外に分泌される細胞外酵素を利用して細胞外の高分子を分解します。[ 22 ]

歴史的に、グラム陽性菌はフィルミクテス門を構成しており、現在ではこの名称は最大のグループに用いられています。フィルミクテス門には、ラクトバチルス属、バチルス属、リステリア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌属、クロストリジウム属など、多くのよく知られた属が含まれます。[ 23 ]また、細胞壁を持たずグラム染色できないマイコプラズマ属やサーモプラズマ属などのモリクテス門も含まれるように拡張されていますが、これらの菌はこれらの菌から派生したものです。[ 24 ]

一部の細菌は、染色性に非常に優れた細胞壁を持っています。これらの細菌は、他のグラム陽性細菌と近縁ではないにもかかわらず、グラム染色で陽性反応を示します。これらは抗酸菌と呼ばれ、特殊な染色法によってのみ他のグラム陽性細菌と鑑別できます。[ 25 ]

グラム陰性細菌

グラム陰性淋菌および膿細胞

グラム陰性細菌は、一般的に2つの膜（二層膜）の間にペプチドグリカンの薄い層を持っています。[ 26 ]リポ多糖（LPS）は、ほとんどのグラム陰性細菌の細胞表面で最も豊富な抗原であり、大腸菌とサルモネラ菌の外膜の最大80％を占めています。[ 27 ]これらのLPS分子は、O抗原またはO多糖、コア多糖、脂質Aで構成されており、細胞の負電荷に寄与したり、特定の化学物質から保護したりするなど、複数の機能を果たします。LPSの役割は宿主と病原体の相互作用において重要であり、O抗原は免疫反応を誘発し、脂質Aはエンドトキシンとして作用します。[ 22 ]

さらに、外膜は選択的バリアとして機能し、特定の分子の通過を可能にする孔を形成する膜貫通タンパク質であるポリンによって制御されます。細胞膜と外膜の間の空間はペリプラズムと呼ばれ、栄養素を処理するペリプラズム酵素が存在します。ペプチドグリカン層と外膜を繋ぐ重要な構造成分であるブラウンリポタンパク質は、細菌細胞壁にさらなる安定性と強度をもたらします。[ 22 ]

細菌門のほとんどはグラム陰性であり、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、およびほとんどのシュードモナス門が含まれる（リケッチア目の一部のメンバーと腸内細菌目の昆虫共生菌は例外である）。[ 9 ] [ 21 ]

グラム可変細菌とグラム不確定細菌

一部の細菌は、グラム染色後、グラム可変パターン、すなわちピンクと紫の細胞が混在するパターンを示す。[ 18 ] [ 28 ]バチルス、ブチリビブリオ、クロストリジウムの培養では、成長中のペプチドグリカンの厚さの減少が、グラム陰性に染まる細胞数の増加と一致している。[ 28 ]さらに、グラム染色を使用して染色されたすべての細菌において、培養の経過年数が染色結果に影響を及ぼす可能性がある。[ 28 ]

グラム不確定細菌はグラム染色に対して予測通りの反応を示さないため、グラム陽性かグラム陰性か判定できません。その例としては、 Mycobacterium bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosisなど、 Mycobacterium属の多くの種が挙げられます。Mycobacterium tuberculosisのうち、Mycobacterium bovisとMycobacterium lepraeはそれぞれハンセン病と結核の原因菌です。[ 29 ] [ 30 ] Mycoplasma属の細菌は細胞膜の周囲に細胞壁を欠いており、[ 11 ]グラム染色法では染色されず、細胞壁合成を阻害する抗生物質にも耐性があります。[ 31 ] [ 32 ]

正書法に関する注記

グラム染色という用語は、ハンス・クリスチャン・グラムの姓に由来する。したがって、名詞(Gram) は大文字で始まるが、科学用語でよくある普通名詞 (stain) は大文字ではない。[ 33 ]名詞の形容詞であるgram-positiveとgram-negativeの頭文字は、作成される文書に適用されているスタイル ガイド(もしあれば)に応じて、大文字のGまたは小文字のgのどちらでも使用できる。小文字スタイルは、米国疾病予防管理センターやAMA スタイルなどのその他のスタイル レジメンで使用されている。[ 34 ]辞書では、小文字、[ 35 ] [ 36 ]大文字、[ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]またはその両方が使用される場合がある。[ 41 ] [ 42 ]多くの科学雑誌の記事や出版物では、大文字のGram-positiveまたはGram-negativeも一般的である。[ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]論文がジャーナルに投稿される際、各ジャーナルはポストプリント版にハウススタイルを適用する場合と適用しない場合があります。プレプリント版には、著者が使用したスタイルが適用されます。グラム陽性とグラム陰性の形容詞を小文字で表記するスタイル規則であっても、グラム染色では大文字を使用するのが一般的です。

参照

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