スポットテスト（地衣類）

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地衣類学におけるスポットテストは、地衣類の識別に用いられるスポット分析である。これは、地衣類の異なる部分に化学試薬を一滴落とし、化学物質の適用に伴う色の変化（またはその欠如）を記録することによって行われる。このテストは地衣類種の二分キーで日常的に見られ、地衣類が生産する地衣類産物（二次代謝産物）の多様性と、それらの分類群間での独自性を利用している。このように、スポットテストは地衣類の様々な部分における化学物質の存在または不在を明らかにする。これは、1866年にフィンランドの地衣類学者ウィリアム・ニールンダーによって、種の識別に役立てる方法として初めて提案された。[ 1 ]

一般的なスポットテストには、10% KOH水溶液 (K テスト)、漂白剤または次亜塩素酸カルシウムの飽和水溶液(C テスト)、または 5% パラフェニレンジアミンアルコール溶液(P テスト) を使用する 3 種類があります。色の変化は、地衣類に含まれる特定の二次代謝産物によって起こります。識別に関する重要な参考文献では、化学スポットテストの結果が地衣類の種を判別するための主要な特徴として用いられています。特定の種を区別するなど、特定の状況で使用される、あまり使用されないが用途が限定的なスポットテストもいくつかあります。この手法には、反応の視認性を高めるためにろ紙を使用する、顕微鏡で観察するなど、さまざまなバリエーションがあり、異なる地衣類の種類や色素沈着に対応しています。結果は通常、観察された物質と反応を示す短いコードで要約されます。紫外線(UV) 照射などの他の診断方法は、地衣類の代謝産物を識別し、種を区別するのに役立ちます。一部の物質はUV 下で蛍光を発するため、近縁種の判別に役立ちます。

テスト

葉状地衣類Punctelia borreriのスポットテスト。上は葉状体、下は髄質を示している。CテストとKCテストにおける髄質のピンクがかった赤色の変化は、ギロフォリック酸の存在を示している。この化学的特徴は、同属の類似種との区別に役立つ。[ 2 ]

地衣類の識別には、4つのスポットテストが最も一般的に使用されます。[ 3 ]

K検定

K テストの試薬は、水酸化カリウム( KOH)の水溶液(10～25%)、または KOH がない場合には 10% 水酸化ナトリウム(NaOH、苛性ソーダ) 水溶液であり、ほぼ同じ結果が得られます。[ 4 ] 10% KOH 溶液は、約 6 か月から 1 年間有効性を維持します。[ 5 ]このテストは塩の形成に依存し、分子内に少なくとも 1 つの酸性官能基が存在する必要があります。構造の一部としてキノンを含む地衣類の化合物は、暗赤色から紫色を生成します。例として、アントラキノン、ナフトキノン、およびテルフェニルキノンなどの色素があります。黄色から赤色は、K テストと一部のデプシド(アトラノリンおよびタムノール酸を含む)、および多くの β-オルシノールデプシドンで生成されます。対照的に、キサントン、プルビン酸誘導体、ウスニン酸は反応を起こさない。[ 4 ]

広く分布する一般的な地衣類の中には、Kに陽性反応を示す地衣類産物を持つものがあり、その例としては、パリエチン（アントラキノンの一種）に起因するK+（赤紫色）のXanthoria parietinaや、ジデプシド化合物であるバエオミセス酸に起因するK+（黄色）のDibaeis baeomycesなどが挙げられる。[ 6 ]

Cテスト

この試験では、次亜塩素酸カルシウム（漂白剤）の飽和溶液、または次亜塩素酸ナトリウムの希釈溶液（通常は5.25%を使用）、あるいは家庭用漂白剤の原液を使用します。これらの溶液は24～48時間以内に分解するため、通常は毎日交換します。日光にさらされるとさらに急速に分解するため（1時間未満）、暗色のボトルに保管することをお勧めします。これらの溶液の分解を促進する他の要因としては、熱、湿度、二酸化炭素などがあります。[ 7 ]

Cテストで典型的に観察される色は、赤とオレンジがかったローズです。赤色反応を引き起こす化学物質には、アンジア酸、エリスリン、レカノリン酸などがあり、オレンジがかった赤色反応を引き起こす化学物質には、ギロフォリン酸などがあります。[ 8 ]まれに、ジヒドロキシジベンゾフランとの反応によりエメラルドグリーンが生成されます。[ 9 ]例えば、化学物質ストレプシリンなどです。[ 8 ]このテストで生成されるもう1つのまれな色は黄色で、これはジベンゾフランウスニン酸の結果として、イワヒバリで観察されます。[ 10 ]

Cに陽性反応を示す地衣類産物を持つ、一般的で広く分布する地衣類には、キサントンチオファン酸のためC+（オレンジ）であるLecanora expallensや、ジデプシドジプロシステス酸のためC+（赤）であるDiploschistes muscorumなどがある。[ 10 ]

PDテスト

p-フェニレンジアミン

これはPテストとしても知られています。パラフェニレンジアミン（PD）の1～5％エタノール溶液を使用します。これは、この化学物質の結晶数個にエタノール（70～95％）を一滴垂らすことによって作られます。これにより、約1日持続する不安定で光に敏感な溶液が得られます。[ 11 ]この溶液の代替形態であるシュタイナー溶液は、はるかに長持ちしますが、発色は弱くなります。通常、PD 1グラム、亜硫酸ナトリウム10グラム、洗剤0.5ミリリットルを水100ミリリットルに溶かして作ります。最初はピンク色ですが、時間が経つにつれて溶液は紫色に変わります。シュタイナー溶液は数ヶ月間持続します。[ 5 ]フェニレンジアミンはアルデヒドと反応して、次の反応に従ってシッフ塩基を生成します。 [ 9 ]

R−CHO + H 2 NC 6 H 4 −NH 2 → R−​​CH=NC 6 H 4 −NH 2 + H 2 O

この反応の生成物は黄色から赤色です。ほとんどのβ-オルシノールデプシドンと一部のβ-オルシノールデプシドは陽性反応を示します。[ 11 ] PD試験は、K+反応で黄色または赤色の反応を示す物質に高い特異性を示すことで知られており、より簡便ではあるものの決定的な結果が得られないK試験に取って代わるようになりました。[ 12 ] PDは粉末でも溶液でも有毒であり、PDと接触した表面（皮膚を含む）は変色します。[ 13 ]

リンに陽性反応を示す地衣類産物を持つ、一般的で広く分布する地衣類には、ジデプシドアトラノリンによりPD+（黄色）となるパルメリア・スブルデクタや、デプシドンフィソダリン酸によりPD+（オレンジ色）となるヒポギムニア・フィソデスなどがある。 [ 14 ]

KCテスト

このスポットテストは、葉状体をK で濡らし、その直後に C を塗布することで実施できます。最初に K を塗布すると、デプシドおよびデプシドンのエステル結合が（加水分解によって）分解されます。別のヒドロキシル基に対してメタ位にあるフェノール性水酸基が遊離すると、C を塗布すると赤からオレンジ色が生成されます。[ 15 ]アレクトロン酸とフィゾジン酸がこの色を生成し、ピクロリケン酸が存在すると紫色になります。CK テストは、化学物質の塗布順序を逆にするあまり一般的ではないバリエーションです。これは、Cladonia floerkeanaに存在するバルバチン酸またはディフラクタ酸によって生成されるオレンジ色をテストする特別な場合に使用されます。[ 8 ]ルゴールヨウ素は、特定の種の識別に有用な別の試薬です。[ 16 ]

Hypogymnia tubulosaはデプシドンフィソジン酸によりKC+（オレンジピンク）の色を呈する地衣類であり、 Cetrelia olivetorumはデプシドンアレクトロン酸によりKC+（ピンク赤）の色を呈する。 [ 10 ]

あまり一般的ではない検査

いくつかのスポット テストは適用範囲が限られているためめったに使用されませんが、特定の地衣類の代謝産物を検出する必要がある場合や、他のテストが陰性の場合に特定の種を区別する必要がある場合に役立つことがあります。

スポットテストの実施

地衣類Aspicilia epiglyptaの化学スポットテスト

スポットテストは、検査する地衣類の部分に少量の試薬を垂らすことで行います。多くの場合、地衣類の皮質と髄質の両方が検査されますが、時にはソラリアなどの他の構造を検査することが有用です。1つの方法は、少量の化学物質をガラス毛細管に吸い上げ、地衣類の体細胞に接触させることです。小さな絵筆もこの目的に使用できます。反応は、拡大鏡または実体顕微鏡で最もよく観察できます。[ 8 ]カミソリの刃を使用して皮質を取り除き、髄質にアクセスすることもできます。あるいは、ソラリア、偽胞子、または鱗片の裏側など、皮質がないか髄質が露出している地衣類の特徴に溶液を塗布することもできます。 [ 20 ]

スウェーデンの化学者ヨハン・サンテッソンによって提案されたこの技術のバリエーションでは、ろ紙を使用して色反応をより容易に観察しようとします。地衣類の断片をろ紙の上に押し付け、地衣類の物質を10～20滴のアセトンで抽出します。アセトンを蒸発させた後、地衣類の物質は地衣類の断片の周りの輪状にろ紙の上に残ります。その後、ろ紙を通常の方法でスポットテストできます。[ 22 ]仮根でのスポットテストの結果が不確かな場合は、カバーガラスの下で少量の水と試薬の中で組織の薄片を顕微鏡のスライドグラスに押し付けることができます。色の変化は、低倍率の顕微鏡対物レンズの下で、またはスライドグラスを白い背景に置いたときに確認できます。[ 8 ]この技術は、ブリオリアなどの暗い色素を持つ地衣類をテストするときに便利です。[ 5 ]

スポットテストは単独でも組み合わせても使用できます。スポットテストの結果は通常、短いコードで表されます。このコードには、(1) 使用した試薬を示す文字、(2) 色の変化または色の変化がないことを示す「+」または「-」記号、(3) 観察された色を示す文字または単語が順に含まれています。さらに、地衣類のどの部分をテストしたかを明確に示す必要があります。例えば、「皮質 K+ オレンジ、C-、P-」は、試験片の皮質がKOHの適用によりオレンジ色に変化し、漂白剤またはパラフェニレンジアミンでは変化しなかったことを意味します。同様に、「髄質 K-、KC+R」は、地衣類の髄質がKOHの適用には反応しないが、KOHの適用直後に漂白剤を塗布すると髄質が赤色に変化したことを示します。[ 12 ]

場合によっては、色の変化が現れるまで時間がかかることがあります。例えば、ある種のクラドニア属では、フマルプロトセトラリン酸とのPD反応に30秒ほどかかることがあります。[ 13 ]一方、CおよびKCとの反応は通常一瞬で、試薬を塗布してから1秒以内に起こるため、色の変化を見逃してしまう可能性があります。期待通りの結果が得られない理由はいくつか考えられます。古い試薬や化学的に不活性な試薬、サンプル中の地衣類物質の濃度が低いことなどが挙げられます。仮根の色が濃い場合は、色の変化が分かりにくい可能性があり、ろ紙法などの他の手法の方が適しています。[ 8 ]

その他のテスト

地衣類の表面のクローズアップ。凹凸のある表面に、黄緑色のカップ状の構造が 2 つ現れています。
紫外線照射を受けた地衣類オクロレキア・アフリカナの仮根と子嚢殻。黄色はリヘキサントンの蛍光によるものである。[ 23 ]

スポットテストに加えて、他の診断方法を行うことが有用な場合もあります。例えば、地衣類の代謝物の中には紫外線下で蛍光を発するものがあり、地衣類の特定の部分を紫外線源にさらすと、スポットテストと同様にそれらの代謝物の有無を明らかにすることができます。紫外線下で明るい蛍光を発する地衣類物質の例としては、アレクトロニック酸、ロバリック酸、ジバリカティック酸、リヘキサントンなどがあります。場合によっては、紫外線光テストを使用して、Cladonia deformis（UV−）とCladonia sulphurina （鱗状酸の存在によりUV+ ）などの近縁種を区別するのに役立ちます。[ 20 ]地衣類を直接観察するには、長波長の紫外線のみが有用です。[ 5 ]

薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法などのより高度な分析技術も、地衣類の化学組成を最初に特徴付ける場合や、スポットテストで何も明らかにならない場合に役立つ可能性があります。[ 24 ]

歴史

フィンランドの地衣類学者ウィリアム・ニールンダーは、地衣類の識別を助ける化学物質の使用を初めて実証した人物であると一般に考えられています。[ 25 ] 1866年に発表された論文では、特徴的な色反応（通常は黄色、赤、緑）を得るためにKOHと漂白剤を使用したスポットテストを提案しました。 [ 1 ] [ 26 ] [ 27 ]これらの研究で彼は、例えば、現在Cetrelia cetrarioidesとC. olivetorumとして知られている地衣類は、後者ではC+赤であるのに対し、前者では反応しないなど、異なる種として区別できることを示しました。ニールンダーは、前者の種ではパリエチンの存在が強い色反応を引き起こすため、 KOHを使用してXanthoria candelariaとCandelaria concolorの類似種を区別する方法を示しました。彼はまた、地衣類の化学物質が皮質と髄質に均等に分布していないケースがあり、それによって色反応が異なることを知っていました。[ 25 ] 1930年代半ば、朝比奈康彦はパラフェニレンジアミンを用いた試験を開発しました。これは、遊離アルデヒド基を持つ二次代謝物と黄色から赤色の反応を示すものです。[ 28 ] [ 29 ]このスポットテストは後に、ミコウゾ科の分類学において特に有用であることが示されました。[ 30 ] [ 25 ]

参照

参考文献

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引用文献

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