蛍光体

蛍光標識されたヒト細胞

蛍光体（または蛍光色素、発色団に類似）は、光励起によって光を再放出できる蛍光 化合物です。蛍光体は通常、複数の芳香族基、または複数のπ結合を持つ平面状または環状分子で構成されています。[1]

蛍光体は、単独で使用される場合もあれば、液体中のトレーサー、特定の構造を染色するための染料、酵素の基質、あるいはプローブや指示薬（極性やイオンなどの環境要因によって蛍光が影響を受ける場合）として使用される場合もあります。より一般的には、蛍光体は高分子に共有結合し、親和性試薬または生物活性試薬（抗体、ペプチド、核酸）のマーカー（または染料、タグ、レポーター）として機能します。蛍光体は、蛍光イメージングや分光法など、様々な分析方法において、組織、細胞、または材料を染色するために特に使用されます。

フルオレセイン は、アミン反応性イソチオシアネート誘導体であるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を介して、最も広く利用されている蛍光色素の一つです。抗体標識から、カルボキシフルオレセインのおかげで核酸への応用が広がっています。歴史的に広く利用されてきた他の蛍光色素としては、ローダミン誘導体（TRITC）、クマリン、シアニン などがあります。[2]新世代の蛍光色素（その多くは独自開発）は、励起光と発光光度が同等の従来の色素と比較して、光安定性、輝度、pH依存性の低さなど、優れた性能を示すことがよくあります。[3] [4]

蛍光

蛍光体は特定の波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長の光を再放出します。吸収波長、エネルギー移動効率、および放出までの時間は、蛍光体の構造と化学的環境の両方に依存します。これは、励起状態の分子が周囲の分子と相互作用するためです。最大吸収（≈励起）および放出波長（たとえば、吸収/放出 = 485 nm/517 nm）は、特定の蛍光体を指すために使用される一般的な用語ですが、スペクトル全体を考慮することが重要になる場合があります。励起スペクトルは非常に狭いまたはより広い帯域である場合があり、またはすべてカットオフレベルを超えている場合があります。放出スペクトルは通常、励起スペクトルよりも鋭く、波長が長く、それに応じてエネルギーが低くなります。励起エネルギーは紫外線から可視スペクトルまでの範囲であり、放出エネルギーは可視光から近赤外線領域まで続く場合があります。

蛍光体の主な特性は次のとおりです。

  • 最大励起および発光波長（ナノメートル（nm）で表されます）：励起スペクトルと発光スペクトルのピークに対応します（通常、それぞれ 1 つのピーク）。
  • モル吸光係数（mol −1 cm −1単位）：特定の波長における吸収光の量と溶液中の蛍光体の濃度を結び付けます。
  • 量子収率: 入射光から放出された蛍光に伝達されるエネルギーの効率（吸収された光子あたりの放出された光子の数）。
  • 蛍光寿命（ピコ秒）：蛍光体が励起状態から基底状態に戻るまでの持続時間。励起された蛍光体の集団が元の量の1/ e （≈0.368）まで減衰するのにかかる時間を指します。
  • ストークスシフト: 最大励起波長と最大発光波長の差。
  • ダークフラクション：蛍光を発しない分子の割合。量子ドットの場合、長時間の単分子顕微鏡観察により、全粒子の20～90%は蛍光を発しないことが明らかになった。[5]一方、共役ポリマーナノ粒子（Pdot）では、蛍光にダークフラクションはほとんど見られなかった。[6] 蛍光タンパク質は、タンパク質のミスフォールディングや発色団形成の欠陥によってダークフラクションを持つことがある。[7]

これらの特性は、光退色や光耐性（連続光励起による蛍光の消失）といった他の特性にも影響を与えます。蛍光体分子の極性、蛍光体のサイズと形状（偏光蛍光パターンなど）、その他の要因によって蛍光体の挙動が変化する可能性があるため、他のパラメータも考慮する必要があります。

蛍光体は、他の蛍光染料の蛍光を消光したり、さらに長い波長で蛍光を中継したりするためにも使用できます。

サイズ（分子量）

ほとんどの蛍光体は20～100原子（200～1000ダルトン。グラフト修飾や共役分子によっては分子量がさらに高くなる場合がある）の有機小分子であるが、タンパク質からなるはるかに大きな天然蛍光体も存在する。緑色蛍光タンパク質（GFP）は27kDa 、いくつかのフィコビリタンパク質（PE、APCなど）は約240kDaである。2020年現在、最も小さい既知の蛍光体は3-ヒドロキシイソニコチンアルデヒドとされており、これは14原子でわずか123Daの化合物である。[8]

量子ドット（直径2～10 nm、原子100～10万個）のような蛍光粒子も蛍光体と考えられている。[9]

蛍光体のサイズにより、タグ付けされた分子が立体的に妨害され、蛍光極性に影響を及ぼす可能性があります。

家族

紫外線下での様々な物質の蛍光。緑はフルオレセイン、赤はローダミンB、黄色はローダミン6G、青はキニーネ、紫はキニーネとローダミン6Gの混合物です。水溶液の濃度は約0.001%です。

蛍光分子は単独で利用することも、機能システムの蛍光モチーフとして利用することもできます。分子の複雑さと合成方法に基づいて、蛍光分子は一般的に4つのカテゴリーに分類されます。タンパク質とペプチド、低分子有機化合物、合成オリゴマーとポリマー、そして多成分系です。[10] [11]

蛍光タンパク質GFP、YFP、RFP (それぞれ緑、黄、赤) は、他の特定のタンパク質に結合して融合タンパク質を形成し、適切なプラスミドキャリアのトランスフェクション後に細胞内で合成されます。

非タンパク質有機蛍光体は、以下の主要な化学ファミリーに属します。

これらの蛍光体は、非局在化した電子がバンドを飛び越え、吸収したエネルギーを安定化させることで蛍光を発します。例えば、最も単純な芳香族炭化水素の一つであるベンゼンは、254 nmで励起され、300 nmで発光します。[12]この特性により、蛍光体と量子ドット（蛍光半導体ナノ粒子）を区別することができます。

これらは、アミノ基 (活性エステル、カルボキシレート、イソチオシアネート、ヒドラジン)、カルボキシル基 (カルボジイミド)、チオール(マレイミド、アセチルブロミド)、有機アジド(クリックケミストリー経由、または非特異的 (グルタルアルデヒド)) などの特定の官能基にタンパク質に結合できます。

さらに、様々な官能基が存在することで、溶解性などの特性を変化させたり、糖に結合するボロン酸や、特定の陽イオンに結合する複数のカルボキシル基など、特殊な特性を付与したりすることができます。染料が芳香族系の両端に電子供与性基と電子受容性基を持つ場合、この染料は環境の極性に敏感になる可能性が高く（ソルバトクロミック）、そのため環境感受性と呼ばれます。染料はしばしば細胞内で使用されるため、細胞は荷電分子を透過しません。その結果、カルボキシル基はエステルに変換され、細胞内のエステラーゼによって除去されます（例えば、フラ-2AMやフルオレセイン二酢酸など）。

以下の染料ファミリーは商標グループであり、必ずしも構造上の類似性を共有するものではありません。

ウシ肺動脈内皮細胞核をDAPIで青く染色し、ミトコンドリアをMitoTracker Red CMXRosで赤く染色し、F-アクチンをAlexa Fluor 488ファロイジンで緑に染色し、蛍光顕微鏡で画像化しました。
  • CF染料（バイオチウム）
  • DRAQおよびCyTRAKプローブ（BioStatus）
  • ボディピー（インビトロジェン）
  • エバーフルオール（セタレ・バイオテック）
  • Alexa Fluor（インビトロジェン）
  • ベラフルオール（セタレ・バイオテック）
  • DyLight Fluor（サーモサイエンティフィック、ピアス）
  • AttoとTracy（シグマアルドリッチ）
  • FluoProbes (インターキム)
  • アベリオール染料（アベリオール）
  • DY および MegaStokes 染料 (Dyomics)
  • スルホサイ染料（シアンダイ）
  • HiLyte Fluor（アナスペック）
  • Seta、SeTau、および Square Dyes (SETA BioMedicals)
  • QuasarおよびCal Fluor染料（Biosearch Technologies）
  • SureLight 染料 ( APC、RPE PerCP、フィコビリソーム) (コロンビアバイオサイエンス)
  • APC、APCXL、RPE、BPE（Phyco-Biotech、Greensea、Prozyme、Flogen）
  • Vio Dyes（ミルテニー・バイオテック）

よく見られる蛍光体の例

反応性染料と共役染料

染料Ex (nm)Em (nm)MW注記
ヒドロキシクマリン325386331スクシンイミジルエステル
アミノクマリン350445330スクシンイミジルエステル
メトキシクマリン360410317スクシンイミジルエステル
カスケードブルー（375）;401423596ヒドラジド
パシフィックブルー403455406マレイミド
パシフィックオレンジ403551
3-ヒドロキシイソニコチンアルデヒド385525123QY 0.15; pHに敏感
ルシファーイエロー425528
大したことない466539294NBD-X
R-フィコエリスリン（PE）480;56557824万
PE-Cy5コンジュゲート480;565;650670別名サイクローム、R670、トリカラー、クォンタムレッド
PE-Cy7コンジュゲート480;565;743767
レッド613480;565613PE-テキサスレッド
パーCP49067535kDaペリジニンクロロフィルタンパク質
トゥルーレッド490,675695PerCP-Cy5.5コンジュゲート
フルオルX494520587（GEヘルスケア）
フルオレセイン495519389FITC; pH感受性
ボディピーFL503512
G-Dye100498524タンパク質標識および電気泳動に適している
G-Dye200554575タンパク質標識および電気泳動に適している
G-Dye300648663タンパク質標識および電気泳動に適している
G-Dye400736760タンパク質標識および電気泳動に適している
サイ2489506714QY 0.12
サイ3（512）;550570;(615)7670.15 個
Cy3B558572;(620)658QY 0.67
Cy3.5581594;(640)11020.15 個
サイ5（625）;650670792QY 0.28
Cy5.56756941272QY 0.23
Cy7743767818QY 0.28
TRITC547572444TRITC
X-ローダミン570576548XRITC
リサミンローダミンB570590
テキサスレッド589615625塩化スルホニル
アロフィコシアニン（APC）650660104k
APC-Cy7コンジュゲート650;755767遠赤

略語:

核酸色素

染料Ex (nm)Em (nm)MW注記
ヘキスト33342343483616AT選択的
ダピ345455AT選択的
ヘキスト33258345478624AT選択的
SYTOXブルー431480約400DNA
クロモマイシンA3445575CG選択
ミトラマイシン445575
ヨーヨー14915091271
エチジウムブロマイド210;285605394水溶液中
ジェルレッド290;5205951239エチジウムブロマイドの無毒な代替品
アクリジンオレンジ503530/640DNA/RNA
SYTOXグリーン504523約600DNA
TOTO-1、TO-PRO-1509533バイタルステイン、TOTO：シアニンダイマー
TO-PRO: シアニンモノマー
チアゾールオレンジ510530
CyTRAK オレンジ520615-（バイオステータス）（赤色励起暗）
ヨウ化プロピジウム（PI）536617668.4
LDS 751543;590712;607472DNA（543ex/712em）、RNA（590ex/607em）
7-AAD5466477-アミノアクチノマイシンD、CG選択的
SYTOXオレンジ547570約500DNA
TOTO-3、TO-PRO-3642661
ドラク5600/647697413（バイオステータス）（使用可能な励起は488まで）
ドラク7599/644694約700（バイオステータス）（使用可能な励起は488まで）

細胞機能染料

染料Ex (nm)Em (nm)MW注記
インド1361/330490/4051010AMエステル、低/高カルシウム（Ca 2+）
フルオ3506526855AMエステル。pH > 6
フルオ4491/4945161097AMエステル。pH 7.2
DCFH5055355292'7'ジクロロジヒドロフルオレセイン、酸化型
DHR505534346ジヒドロローダミン123、酸化型、光が酸化を触媒する
スナーフ548/579587/635pH 6/9

蛍光タンパク質

染料Ex (nm)Em (nm)MWQYBR追伸注記
GFP（Y66H変異）360442
GFP（Y66F変異）360508
EBFP3804400.180.27モノマー
EBFP238344820モノマー
アズライト38344715モノマー
GFPuv385508
T-サファイア3995110.602625弱い二量体
セルリアン4334750.622736弱い二量体
mCFP4334750.401364モノマー
mターコイズ24344740.9328モノマー
ECFP4344770.153
サイペット4354770.511859弱い二量体
GFP（Y66W変異）436485
mKeima-Red4406200.243モノマー（MBL）
タグCFP45848029二量体（エブロゲン）
アムシアン14584890.7529テトラマー（クロンテック）
mTFP146249254二量体
GFP（S65A変異）471504
緑石シアン4724950.925二量体（MBL）
野生型GFP396,47550826k0.77
GFP（S65C変異）479507
ターボGFP48250226k0.5337二量体（エブロゲン）
タグGFP48250534モノマー（エブロゲン）
GFP（S65L変異）484510
エメラルド4875090.68390.69弱い二量体（Invitrogen）
GFP（S65T変異）488511
EGFP48850726k0.6034174弱い二量体（クロンテック）
アザミグリーン4925050.7441モノマー（MBL）
ZsGreen1493505105k0.9140テトラマー（クロンテック）
タグYFP50852447モノマー（エブロゲン）
EYFP51452726k0.615160弱い二量体（クロンテック）
トパーズ51452757モノマー
金星5155280.575315弱い二量体
mシトリン5165290.765949モノマー
Yペット5175300.778049弱い二量体
ターボYFP52553826k0.5355.7二量体（エブロゲン）
ZsYellow15295390.6513テトラマー（クロンテック）
クサビラオレンジ5485590.6031モノマー（MBL）
mオレンジ5485620.69499モノマー
アロフィコシアニン（APC）652657.5105 kDa0.68ヘテロ二量体、架橋[13]
mKO5485590.6031122モノマー
ターボRFP55357426k0.6762二量体（エブロゲン）
tdトマト5545810.699598タンデム二量体
タグRFP55558450モノマー（エブロゲン）
DsRedモノマー556586約28,0000.13.516モノマー（クロンテック）
DsRed2（「RFP」）563582約11万0.5524（クロンテック）
mストロベリー5745960.292615モノマー
ターボFP60257460226k0.3526二量体（エブロゲン）
AsRed2576592約11万0.2113テトラマー（クロンテック）
mRFP1584607約3万0.25モノマー（Tsien研究室）
J-レッド5846100.208.813二量体
R-フィコエリスリン（RPE）565 >498573250 kDa0.84ヘテロ三量体[13]
B-フィコエリスリン（BPE）545572240 kDa0.98ヘテロ三量体[13]
mCherry5876100.221696モノマー
HcRed1588618約5万2千0.030.6二量体（クロンテック）
カチューシャ58863523二量体
P3 2024年8月21日アーカイブWayback Machine614662約10,000 kDaフィコビリソーム複合体[13]
ペリジニンクロロフィル（PerCP）48367635 kDaトリマー[13]
mKate (TagFP635)58863515モノマー（エブロゲン）
ターボFP63558863526k0.3422二量体（エブロゲン）
mプラム59064951.4キロ0.104.153
mラズベリー5986250.1513モノマー、mPlumよりも速い光退色
mスカーレット5695940.7071277モノマー[14]

高度な蛍光タンパク質

StayGoldとmStayGoldは、生細胞イメージング分野に大きく貢献した先進的な蛍光タンパク質です。高い光安定性と輝度で知られるStayGoldは、当初は二量体蛍光タンパク質として設計されましたが、これは効果的である一方で、凝集と標識精度に関する課題を抱えていました。[15]これらの限界に対処するため、mStayGoldは単量体変異体として設計され、精密なタンパク質標識における有用性を高めました。mStayGoldは優れた光安定性を示し、高照度条件下でも蛍光を維持し、以前の変異体であるStayGoldと比較して輝度が向上しています。さらに、成熟が速いため、トランスフェクション後のイメージングをより迅速に行うことができます。これらの進歩により、mStayGoldは、単一分子追跡や動的な細胞プロセスの高解像度イメージングなど、様々な用途に使用できる汎用性の高いツールとなり、生物学研究における蛍光タンパク質の能力を拡大しています。[16]

略語:

アプリケーション

蛍光体は、生化学やタンパク質研究の分野で特に重要であり、例えば、免疫蛍光法、細胞分析、[17] 免疫組織化学、[3] [18]および小分子センサー[19] [20]などにおいて重要な役割を果たしています。

ライフサイエンス以外の用途

蛍光海染料

蛍光染料は産業界で幅広く使用されており、「ネオンカラー」と呼ばれています。

参照

参考文献

  1. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). 「第3章 染料と蛍光色素」.生命科学における蛍光顕微鏡. Bentham Science Publishers. pp.  61– 95. ISBN 978-1-68108-519-7. 2017年12月24日閲覧。
  2. ^ Rietdorf J (2005). 顕微鏡技術. 生化学工学/バイオテクノロジーの進歩. ベルリン: Springer. pp.  246–9 . ISBN 3-540-23698-8. 2008年12月13日閲覧。
  3. ^ ab Tsien RY; Waggoner A (1995). 「共焦点顕微鏡用蛍光体」. Pawley JB (編).生物学的共焦点顕微鏡ハンドブック. ニューヨーク: Plenum Press. pp.  267– 74. ISBN 0-306-44826-2. 2008年12月13日閲覧。
  4. ^ Lakowicz, JR (2006).蛍光分光法の原理（第3版）. Springer. p. 954. ISBN 978-0-387-31278-1。
  5. ^ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). 「単一分子の共局在研究は、完全発光型単一量子ドットと暗発光型単一量子ドットの考え方に光を当てる」Small . 7 (14): 2101– 2108. doi :10.1002/smll.201100802. PMID  21710484.
  6. ^ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). 「ヒドロキシ末端共役ポリマーナノ粒子はほぼ1の輝度分率を持ち、IGF1Rナノドメインのコレステロール依存性を明らかにする」ACS Nano . 7 (2): 1137– 1144. doi : 10.1021/nn3042122 . PMC 3584654. PMID  23330847 . 
  7. ^ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). 「単一緑色蛍光タンパク質分子における蛍光発光のリアルタイム光駆動ダイナミクス」. PNAS . 97 (13): 7237– 7242. Bibcode :2000PNAS...97.7237G. doi : 10.1073/pnas.97.13.7237 . PMC 16529. PMID 10860989  . 
  8. ^ Cozens, Tom (2020年12月16日). 「蛍光分子が緑色発光染料のサイズ記録を破る」chemistryworld.com . 2021年12月3日閲覧。
  9. ^ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). 「非毒性量子ドットを蛍光体として用いた発光太陽光集光器のグリーン製造における最近の進歩」. J. Mater. Chem. C. 7 ( 40): 12373– 12387. doi :10.1039/C9TC03520F. S2CID  203003761.
  10. ^ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013)、「蛍光体と生細胞における分子プローブとしての応用」、Curr. Org. Chem.、17 (6): 564– 579、doi :10.2174/1385272811317060003
  11. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). 「第4章 蛍光ラベル」.生命科学における蛍光顕微鏡. Bentham Science Publishers. pp.  96– 134. ISBN 978-1-68108-519-7. 2017年12月24日閲覧。
  12. ^ Omlc.ogi.edu
  13. ^ abcde 「Columbia Biosciences」。2024年8月21日時点のオリジナルよりアーカイブ。2014年6月7日閲覧。
  14. ^ ビンデルス、ダフネ S.;ハーボッシュ、リンゼイ。ヴァン・ウィーレン、ローラ。ポストマ、マーテン。ヴィーゼ、カトリン E.マストップ、マリケ。オーモニエ、シルヴァン。ゴッタルド、ギョーム。ロワイヤン、アントワーヌ。ヒンク、マーク A.ガデラ、テオドルス WJ (2017 年 1 月)。「mScarlet: 細胞イメージング用の明るい単量体赤色蛍光タンパク質」。ネイチャーメソッド。14 (1): 53–56 .土井:10.1038/nmeth.4074。ISSN  1548-7105。PMID  27869816。S2CID 3539874  。
  15. ^ 平野雅彦;安藤涼子。下薗 聡杉山真由;武田典代黒川博出口龍作；遠藤一樹；芳賀 圭;高井戸高玲子。稲浦俊介；松村雄太ハマ・ヒロシ岡田 康藤原貴裕（2022年7月）。 「光安定性が高く、明るい緑色の蛍光タンパク質」。ネイチャーバイオテクノロジー。40 (7): 1132–1142。土井:10.1038/s41587-022-01278-2。ISSN  1546-1696。PMC 9287174。PMID  35468954。 
  16. ^ 安藤涼子;下薗 聡アゴ、ヒデオ。高木 正俊杉山真由;黒川博平野雅彦；新野祐介；上野、行きます。石立文義；藤原隆弘；岡田 康山本正樹；宮脇 淳（2024年4月） 「分子融合および膜標的アプリケーション向けのStayGoldバリアント」。ネイチャーメソッド。21 (4): 648–656。土井:10.1038/s41592-023-02085-6。ISSN  1548-7105。PMC 11009113。PMID  38036853。 
  17. ^ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019). 「高輝度近赤外BODIPY色素を用いたC57BL/6マウスにおける急性肝障害に対する炎症反応の増強生体内光学イメージング」ChemMedChem . 14 (10): 995– 999. doi :10.1002/cmdc.201900181. ISSN  1860-7187. PMID  30920173. S2CID  85544665.
  18. ^ 滝 正康 (2013). 「第5章 細胞内カドミウムのイメージングとセンシング」 Astrid Sigel、Helmut Sigel、Roland KO Sigel (編) 『カドミウム：毒性学から必須元素へ』 Metal Ions in Life Sciences. 第11巻. Springer. pp.  99– 115. doi :10.1007/978-94-007-5179-8_5. PMID  23430772.
  19. ^ Sirbu, Dumitru; Butcher, John B.; Waddell, Paul G.; Andras, Peter; Benniston, Andrew C. (2017-09-18). 「局所励起状態-電荷移動状態結合色素を用いた光応答性ニューロン発火プローブ」(PDF) . Chemistry - A European Journal . 23 (58): 14639– 14649. doi :10.1002/chem.201703366. ISSN  0947-6539. PMID  28833695.
  20. ^ Jiang, Xiqian; Wang, Lingfei; Carroll, Shaina L.; Chen, Jianwei; Wang, Meng C.; Wang, Jin (2018-08-20). 「酸化還元生物学応用における小分子蛍光プローブの課題と機会」. Antioxidants & Redox Signaling . 29 (6): 518– 540. doi :10.1089/ars.2017.7491. ISSN  1523-0864. PMC 6056262. PMID 29320869  . 
  • 蛍光染料データベース
  • 蛍光色素表
  • 分子プローブハンドブック - 蛍光技術とその応用に関する包括的なリソース。
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