III型分泌システム

サルモネラ・チフス菌由来の単離されたT3SS針状複合体の透過型電子顕微鏡画像

III型分泌システム（T3SSまたはTTSS ）は、細菌がエフェクタータンパク質を宿主細胞に分泌し、毒性と定着を促進するために使用する細菌分泌システムの1つです。[1] [2] III型分泌システムはインジェクティソームと同等であると広く考えられてきましたが、インジェクティソームは鞭毛輸送装置のような構造も含むIII型分泌システムの一部に過ぎないと主張する人も多くいます。[3] T3SSは、いくつかの病原性グラム陰性細菌種に見られる針状のタンパク質複合体です。

概要

「タイプIII分泌システム」という用語は1993年に造語されました。[4]この分泌システムは、グラム陰性細菌に見られる少なくとも5つの他の分泌システムとは区別されます。多くの動植物関連細菌は同様のT3SSを有しています。これらのT3SSは収斂進化の結果として類似しており、系統解析はグラム陰性細菌がT3SS遺伝子カセットを他の種に水平伝播できるというモデルを支持しています。最も研究されているT3SSのいくつかは、以下の種に由来します。[要出典]

T3SSは約30種類のタンパク質で構成されており、最も複雑な分泌システムの1つとなっています。その構造は、細菌の鞭毛（運動に用いられる長く硬い細胞外構造）と多くの類似点を示しています。T3SSに関与するタンパク質の中には、鞭毛タンパク質とアミノ酸配列の相同性を持つものがあります。T3SSを持つ細菌の中には、鞭毛も持ち運動性の細菌（例えばサルモネラ）と、持たない細菌（例えば赤痢菌）があります。厳密に言えば、III型分泌は感染関連タンパク質と鞭毛成分の両方の分泌に使用されます。ただし、「III型分泌」という用語は、主に感染装置に関連して使用されます。細菌の鞭毛は、III型分泌システムと共通の祖先を共有しています。[5] [6]

T3SSは多くの病原細菌の病原性（感染能力）に不可欠です。T3SSに欠陥があると、細菌は非病原性になる可能性があります。グラム陰性細菌の一部の非侵襲性株は、エネルギーコストの高いこのシステムがもはや役に立たないため、T3SSを失っていることが示唆されています。[7]従来の抗生物質は過去にこれらの細菌に対して有効でしたが、抗生物質耐性株が絶えず出現しています。1990年代後半以降、T3SSの働きを理解し、それを特異的に標的とする薬剤を開発することは、世界中の多くの研究グループの重要な目標となっています。

構造

III型分泌システム
T3SSニードル複合体
識別子
記号T3SS
TCDB1.B.22
OPMスーパーファミリー348
OPMタンパク質5tcq

T3SSの特徴はニードル[8] [9]（より一般的にはニードル複合体（NC）またはT3SS装置（T3SA）；ATPaseを除いた場合はインジェクティソームとも呼ばれる。下記参照）である。分泌が必要な細菌タンパク質は、細菌細胞質からニードルを通って宿主細胞質に直接排出される。2つの細胞質は3つの膜で隔てられている。グラム陰性細菌の二重膜（内膜と外膜）と真核生物の膜である。ニードルは、これらの高度に選択的でほぼ不透過性の膜をスムーズに通過させる。1つの細菌は、膜全体に数百のニードル複合体を持つことができる。ニードル複合体は、病原性細菌のすべてのT3SSに共通する特徴であると提案されている。[10]

針状複合体は細菌の細胞質から始まり、2つの膜を横切って細胞外に突出します。膜に固定されている部分はT3SSの基部（または基底小体）です。細胞外の部分は針状です。いわゆる内部ロッドが針状体を基部に接続しています。針状体自体はT3SSの中で最大かつ最も目立つ部分ですが、単一のタンパク質の多くのユニットで構成されています。したがって、異なるT3SSタンパク質の大部分は、基部を構築するものと宿主に分泌されるものです。前述のように、針状複合体は細菌の鞭毛と類似点を持っています。より具体的には、針状複合体の基部は構造的に鞭毛基部と非常に類似しており、針状体自体は、基部と鞭毛繊維を接続する構造である鞭毛フックに類似しています。[11] [12]

基部は複数の環状リングで構成され、新しい針状複合体において最初に構築される構造です。基部が完成すると、外側のタンパク質（針状タンパク質）の分泌機構として機能します。複合体全体が完成すると、システムは宿主細胞に送達されるタンパク質の分泌に切り替わります。針状タンパク質は下から上へと構築されると推定されており、針状タンパク質モノマーのユニットが互いに積み重なり、針状タンパク質の先端のユニットは最後に追加されます。針状タンパク質サブユニットはT3SSタンパク質の中で最も小さいものの1つであり、約9 kDaです。1本の針状タンパク質は100～150個のサブユニットで構成されています。

T3SSニードルの長さは約60～80nm 、外幅は8nmです。他の細菌細胞外構造（例えば、接着分子やリポ多糖層）が分泌を妨げないように、最小限の長さにする必要があります。ニードルの穴の直径は3nmです。ほとんどの折り畳まれたエフェクタータンパク質は大きすぎてニードルの開口部を通過できないため、ほとんどの分泌タンパク質は折り畳まれていない状態でニードルを通過する必要があり、この作業は構造の基部にあるATPaseによって行われます。 [13]

T3SSタンパク質

サルモネラ・チフス菌のニードル複合体の個々の部分構造の図

T3SSタンパク質は3つのカテゴリーに分類できます。

  • 構造タンパク質：基部、内部のロッド、ニードルを構築します。
  • エフェクタータンパク質：宿主細胞に分泌され、感染を促進したり、宿主細胞の防御を抑制したりします
  • シャペロン：細菌の細胞質内のエフェクターに結合し、凝集や分解から保護し、針状複合体へと誘導します。

ほとんどのT3SS遺伝子はオペロンに配置されています。これらのオペロンは、種によっては細菌の染色体上に、他の種では専用のプラスミド上に位置しています。例えば、サルモネラ菌には、ほとんどのT3SS遺伝子が集まっている染色体領域、いわゆるサルモネラ病原性アイランド（SPI）があります。一方、赤痢菌は、すべてのT3SS遺伝子が存在する大きな毒性プラスミドを持っています。多くの病原性アイランドとプラスミドには、アイランド／プラスミドの新しい種への頻繁な水平遺伝子伝播を可能にする要素が含まれていることに注意することが重要です

針を通して分泌されるエフェクタータンパク質は、何千もの他のタンパク質と共に細胞質内を浮遊しているため、システムによって認識される必要があります。認識は分泌シグナルを介して行われます。分泌シグナルは、タンパク質の先頭（N末端）に位置する短いアミノ酸配列（通常は最初の20アミノ酸以内）であり、針複合体が認識することができます。他の分泌システムとは異なり、T3SSタンパク質の分泌シグナルはタンパク質から切断されることはありません。

分泌の誘導

針が宿主細胞に接触すると、T3SSの分泌が始まります。[14]この誘発メカニズムについてはあまり分かっていません（下記参照）。分泌は、例えば、増殖培地中のカルシウム イオン濃度を下げること（エルシニアおよびシュードモナスの場合；EDTAやEGTAなどのキレート剤を添加することによって行う）、または増殖培地に芳香族染料コンゴーレッドを添加すること（赤痢菌の場合）によっても誘導できます。これらの方法やその他の方法は、実験室で人工的にIII型分泌を誘導するために使用されています

宿主細胞との接触以外の外部刺激による分泌誘導は、感染生物においても生体内で起こります。細菌は温度、pH、浸透圧、酸素レベルなどの刺激を感知し、それらを用いて三原色細胞分泌刺激（TH3SS）を活性化するかどうかを「決定」します。例えば、サルモネラ菌は動物の腸管では盲腸よりも回腸でよりよく複製・侵入することができます。細菌はこれらの領域に存在する異なるイオンのおかげで自分の位置を知ることができます。回腸にはギ酸と酢酸が含まれていますが、盲腸には含まれていません。細菌はこれらの分子を感知し、回腸にあると判断して分泌機構を活性化します。盲腸に存在するプロピオン酸や酪酸などの分子は、細菌にネガティブな刺激を与え、分泌を阻害します。ほとんど の真核生物の細胞膜に含まれる脂質であるコレステロールは、赤痢菌の分泌を誘導することができます

上記の外部刺激は、分泌を直接または遺伝的メカニズムを介して制御します。T3SS遺伝子の発現を制御する転写因子がいくつか知られています。T3SSエフェクターに結合するシャペロンの中には、転写因子としても機能するものがあります。細菌が分泌しない場合、そのエフェクタータンパク質はシャペロンに結合して細胞質内を浮遊するというフィードバック機構が示唆されています。分泌が始まると、シャペロンはエフェクターから分離し、エフェクターは分泌されて細胞外に排出されます。その後、孤立したシャペロンは転写因子として機能し、エフェクターをコードする遺伝子に結合して転写を誘導し、それによってより多くのエフェクターが生成されます。

3SSインジェクチソームに類似した構造は、グラム陰性細菌の外膜と内膜をリベットで固定し、細菌分泌物を真核生物宿主または他の標的細胞に体内で送達することを目的とした外膜小胞の放出を助けることが提案されています。[15]

T3SS媒介感染

T3SSエフェクターは、基部から針状複合体に入り、針状複合体内を進んで宿主細胞へと向かいます。エフェクターが宿主細胞に侵入する正確な方法はほとんど分かっていません。以前は、針自体が宿主細胞膜に穴を開けることができると示唆されていましたが、この説は反証されています。現在では、トランスロケーターと総称されるいくつかのエフェクターが最初に分泌され、宿主細胞膜に孔またはチャネル（トランスロコン）を形成し、それを介して他のエフェクターが侵入できることが明らかになっています。トランスロケーターを欠損した変異細菌は、タンパク質を分泌することはできますが、宿主細胞に送達することはできません。一般に、各T3SSには3つのトランスロケーターが含まれています。一部のトランスロケーターは2つの役割を果たします。孔形成に関与した後、細胞内に侵入し、真のエフェクター として機能します

T3SSエフェクターは、いくつかの方法で宿主細胞を操作します。最も顕著な効果は、宿主細胞による細菌の取り込みを促進することです。T3SSを持つ多くの細菌は、複製して感染を広めるために宿主細胞に侵入する必要があります。宿主細胞に注入されたエフェクターは、宿主が細菌を飲み込み、事実上「食べる」ように誘導します。これが起こるように、細菌エフェクターは宿主細胞のアクチン 重合機構を操作します。アクチンは細胞骨格の構成要素であり、運動性や細胞形状の変化にも関与しています。細菌はT3SSエフェクターを介して、宿主細胞自身の機構を自身の利益のために利用することができます。細菌が細胞内に侵入すると、他のエフェクターをより容易に分泌できるようになり、隣接する細胞に浸透して組織全体に迅速に感染することができます

T3SSエフェクターは宿主の細胞周期に干渉することも示されており、その一部はアポトーシスを誘導することができる。最も研究されているT3SSエフェクターの一つは、赤痢菌由来のIpaBである。これは、宿主細胞膜に孔を開ける転座因子としての役割と、宿主細胞に複数の有害な影響を及ぼすエフェクターとしての役割という二つの役割を果たす。IpaBは、動物の免疫系細胞であるマクロファージに取り込まれた後、マクロファージにおいてアポトーシスを誘導することが実証されている[16] 。その後、IpaBは真核細胞の主要な調節タンパク質であるカスパーゼ1と相互作用することでアポトーシスを誘導することが示された[17] 。

T3SSエフェクターのよく特徴付けられたもう1つのクラスは、キサントモナス由来の転写活性化因子様エフェクター（TALエフェクター）です。植物に注入されると、これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、植物プロモーター配列に結合し、細菌感染を助ける植物遺伝子の転写を活性化します。[18] TALエフェクター-DNA認識は最近、単純なコードで構成されていることが実証され[19] [20]、これらのタンパク質が宿主植物細胞における遺伝子の転写をどのように変化させることができるかについての理解が大きく深まりました。

未解決の問題

サルモネラ針複合体のトポロジーと組織。 [21]

1990年代半ば以降、T3SSに関する数百の論文が発表されています。しかし、このシステムに関する多くの問題が未解決のままです

  • T3SSタンパク質。約30種類のT3SSタンパク質のうち、生化学的手法を用いて直接検出されたのは、各生物で10種類未満です。残りは、おそらく稀であるため、検出が困難であることが判明しており、理論上のものとなっています（ただし、多くのT3SS遺伝子／タンパク質については、生化学的研究ではなく遺伝学的研究が行われています）。各タンパク質の局在も完全には解明されていません。
  • 針の長さ。細菌が新しい針が適切な長さに達したことをどのように「知る」のかは分かっていません。いくつかの説があり、その中には、針の先端と根元を何らかの形でつなぐ「定規タンパク質」の存在があります。針の先端に新しいモノマーを追加すると、定規タンパク質が伸び、それによって根元までの針の長さが伝えられるはずです
  • エネルギー論。針状構造内のタンパク質の通過を駆動する力は完全には解明されていません。ATPaseはT3SSの基部に結合し、タンパク質を針状構造へ導く役割を果たしますが、輸送に必要なエネルギーを供給するかどうかは明らかではありません。
  • 分泌シグナル。前述のように、エフェクタータンパク質には分泌シグナルが存在することが知られています。このシグナルにより、システムはT3SS輸送タンパク質を他のタンパク質と区別することができます。その性質、要件、および認識メカニズムは十分に解明されていませんが、細菌のどのタンパク質がタイプIII分泌システムによって輸送されるかを予測する方法が最近開発されました。[22]
  • 分泌の活性化。細菌はエフェクターを分泌する適切なタイミングを知る必要があります。宿主細胞が近くにいない場合の不必要な分泌は、細菌にとってエネルギーと資源の無駄です。細菌は何らかの方法で針と宿主細胞の接触を認識することができます。これがどのように行われるかはまだ研究中であり、その方法は病原体によって大きく異なる可能性があります。いくつかの理論では、宿主細胞との接触時に針の構造に微妙な構造変化が起こると仮定しています。この変化は、塩基が分泌を開始するためのシグナルとして機能する可能性があります。認識方法の1つはサルモネラで発見されており、病原性アイランド2にコードされたT3SSを介して宿主細胞の細胞質pHを感知し、エフェクターの分泌をオンにします。[23]
  • シャペロンの結合。シャペロンがいつエフェクターに結合するか（翻訳中か後か）、また分泌前にどのようにエフェクターから解離するかは分かっていません
  • エフェクター機構。21世紀初頭以降、T3SSエフェクターが宿主を操作する方法については多くのことが明らかにされましたが、その効果と経路の大部分は依然として不明です
  • 進化。前述のように、T3SSは細菌の鞭毛と密接に関連しています。[24] 3つの競合する仮説があります。[25] 1つ目は、鞭毛が最初に進化し、T3SSはその構造に由来するという仮説、2つ目は、T3SSが最初に進化し、鞭毛がそれに由来するという仮説、そして3つ目は、2つの構造が共通の祖先に由来するという仮説です。これらの異なるシナリオについては、2つの構造間のタンパク質相同性と機能的多様性を説明するため、いくつかの論争がありました。[5] [ 25 ]しかし、最近の系統ゲノム学的証拠は、T3SSが最初の遺伝子喪失とその後の遺伝子獲得を伴うプロセスによって鞭毛から派生したという仮説を支持しています。[27]後者のプロセスの重要なステップは、T3SSへのセクレチンのリクルートメントであり、これは他の膜関連システムから少なくとも3回発生したイベントです。

T3SSタンパク質の命名法

グラム陰性細菌の鞭毛。基部のリングは針状複合体のリングと非常に似ていますが、針状複合体にCリングが存在するかどうかは証明されていません。鞭毛フックはT3SS針状タンパク質と相同です。

1990年代初頭から、さまざまな細菌種で新しいT3SSタンパク質が着実に発見されています。各生物のタンパク質シリーズごとに略語が付けられており、通常、名前からタンパク質の機能について多くは明らかにされていません。異なる細菌で独立して発見されたタンパク質の中には、後に相同であることが示されたものもあります。しかし、歴史的な名前はほとんどそのまま残されており、混乱を招く可能性があります。例えば、SicA、IpgC、SycDというタンパク質は、それぞれサルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア菌の相同タンパク質ですが、名前の最後の文字（「シリアル番号」）にはそれが示されていません

以下は、いくつかのT3SS含有種における最も一般的なタンパク質シリーズ名の要約です。これらの名称には、T3SS機構を形成するタンパク質と分泌エフェクタータンパク質が含まれていることに注意してください。

  • エルシニア
    • Yop：エルシニア外殻タンパク質
    • Ysc：エルシニア分泌物（成分）
    • Ypk：エルシニアタンパク質キナーゼ
  • サルモネラ
    • Spa：抗原の表面提示
    • Sic：サルモネラ侵入シャペロン
    • Sip：サルモネラ侵入タンパク質
    • Prg：PhoP抑制遺伝子
    • Inv：侵入
    • Org：酸素調節遺伝子
    • Ssp：サルモネラ分泌タンパク質
    • Iag：侵入関連遺伝子
  • 赤痢菌
    • Ipg：侵入プラスミド遺伝子
    • Ipa：侵入プラスミド抗原
    • Mxi：Ipaの膜発現
    • Spa：抗原の表面提示
    • Osp：赤痢菌外殻タンパク質
  • 大腸菌
    • Tir：転座インチミン受容体
    • Sep ：大腸菌タンパク質の分泌
    • Esc：大腸菌分泌物（成分）
    • Esp：大腸菌分泌タンパク質
    • Ces ：大腸菌分泌物のシャペロン
  • シュードモナス
    • Hrp：過敏反応と病原性
    • Hrc：過敏反応の保存（またはHrpの保存）
  • 根粒菌
    • Nop：根粒形成タンパク質
    • Rhc：根粒菌の保存
  • いくつかの種において：
    • Vir：毒性
  • 「プロトクラミジア・アメーボフィラ」
  • 「ソダリス・グロッシニディウス」[28]

これらの略語の後には、文字または数字が続きます。文字は通常、「シリアル番号」を示し、これは発見された年代順またはオペロンにおける遺伝子の物理的な出現順序のいずれかです。数字は、まれに、タンパク質の分子量（kDa）を示します。例：IpaA、IpaB、IpaC、MxiH、MxiG、MxiM、Spa9、Spa47。

すべてのT3SSには、いくつかの重要な要素が含まれています。針状単量体、針状体の内部ロッド、リングタンパク質、2つの転座タンパク質、針状体先端タンパク質、ルーラータンパク質（針状体の長さを決定すると考えられている。上記参照）、および分泌のためのエネルギーを供給するATPaseです。次の表は、4つのT3SSを含む細菌におけるこれらの主要なタンパク質の一部を示しています。

↓ 機能 / 属 →赤痢菌サルモネラエルシニア大腸菌
針状単量体MxiHPrgIYscFEscF
内側ロッドMxiIPrgJYscIEscI
針状タンパク質IpaDSipDLcrVEspA
転座タンパク質IpaBSipBYopBEspD
転座タンパク質IpaCSipCYopDEspB
2つの転座タンパク質のシャペロンIpgCSicASycDCesD
ATPアーゼSpa47InvCYscNSepB (EscN)
ルーラータンパク質Spa32InvJYscPOrf16
スイッチSpa40SpaSYscUEscU
ゲートキーパーMxiCInvEYopN (TyeA)SepL

T3SS研究で用いられる方法

T3SS針状複合体の単離

細胞から大きく脆弱な疎水性膜構造を分離することは、長年の課題でした。しかし、1990年代末までに、T3SS NCを分離するためのいくつかのアプローチが開発されました。1998年には、最初のNCがサルモネラ・チフス菌から分離されました。[29]

細菌を分離するには、まず大量の液体培地で対数増殖期に達するまで培養します。その後、遠心分離し、上清（培地）を捨て、ペレット（細菌）を溶解緩衝液に再懸濁します。この緩衝液には、通常リゾチームが含まれますが、 LDAOやTriton X-100などの界面活性剤が含まれる場合もあります。この緩衝液は細胞壁を分解します。数回の溶解と洗浄の後、開いた細菌は一連の超遠心分離にかけられます。この処理により、大きな高分子構造が濃縮され、小さな細胞成分が除去されます。必要に応じて、最終的な溶解液はCsCl密度勾配によってさらに精製されます。

さらなる精製のための追加のアプローチとして、アフィニティークロマトグラフィーが使用されます。タンパク質タグ（例えばヒスチジンタグ）を有する組換えT3SSタンパク質は、分子クローニングによって作製され、研究対象の細菌に導入（形質転換）されます。前述のように、最初のNC分離後、溶解物はタグに高い親和性を持つ粒子（ヒスチジンタグの場合はニッケルイオン）でコーティングされたカラムに通されます。タグ付けされたタンパク質はカラム内に保持され、針状複合体全体も保持されます。このような方法を用いることで、高い純度を達成できます。この純度は、NCの特性評価に使用されてきた多くの繊細なアッセイにとって不可欠です。

III型エフェクターは1990年代初頭から知られていましたが、宿主細胞に送達される方法は全くの謎でした。多くの鞭毛タンパク質とT3SSタンパク質間の相同性から、研究者は鞭毛に類似した外側のT3SS構造の存在を疑いました。針状構造の同定とその後の分離により、研究者は以下のことが可能になりました

  • NCの3次元構造を詳細に特徴付け、これを通じて分泌のメカニズムに関する結論を導き出す（例えば、針状構造の幅が狭いため、分泌前にエフェクターの展開が必要であることなど）。
  • 単離した針状構造をプロテオーム解析にかけることで、NCのタンパク質成分を分析する（下記参照）。
  • T3SS遺伝子をノックアウトし、変異細菌からNCを単離し、変異によって引き起こされた変化を調べることで、さまざまなNC成分に役割を割り当てる。

顕微鏡検査、結晶構造解析、固体NMR

ほとんどすべてのタンパク質と同様に、T3SS NC の可視化は電子顕微鏡でのみ可能です。NC の最初の画像 (1998 年) では、生きた細菌の細胞壁から突き出た針状構造と、平坦で二次元的に分離された NC が示されました。[29] 2001 年には、 Shigella flexneriの NC の画像がデジタル分析され、平均化されて、NC の最初の半 3D 構造が得られました。[8] Shigella flexneriの NC のらせん構造は、2003 年にX 線繊維回折法を使用して16 Åの解像度で解明され、 [30] 1 年後には、Salmonella typhimuriumの NC の17 Åの 3D 構造が発表されました。[31]最近の進歩とアプローチにより、NC の高解像度の 3D 画像が可能になり、[32] [33] NC の複雑な構造がさらに明らかになりました。

長年にわたり、数多くのT3SSタンパク質が結晶化されてきました。これらには、NC、エフェクター、シャペロンの構造タンパク質が含まれます。針状複合体モノマーの最初の構造は、Burkholderia pseudomallei由来のBsaLのNMR構造であり、その後、Shigella flexneri由来のMixHの結晶構造が2006年に解明されました。[34] [35]

2012年、組換え野生型針状タンパク質の作製、固体NMR、電子顕微鏡[36]、およびロゼッタモデリングの組み合わせにより、サルモネラ・チフス菌T3SS針状タンパク質の超分子界面、そして最終的には完全な原子構造が明らかになりました[37] 。80残基のPrgIサブユニットは、サルモネラ・チフス菌の鞭毛と同様に、2回転あたり約11サブユニットの右巻きらせん構造を形成することが示されました。このモデルはまた、針状タンパク質の表面に位置する延長されたアミノ末端ドメインと、高度に保存されたカルボキシ末端が内腔に向いていることを明らかにしました[37] 。

プロテオミクス

T3SSを構成するタンパク質の配列を同定するために、いくつかの方法が用いられてきました。単離された針状複合体はSDS-PAGEで分離できます。染色後に現れるバンドはゲルから個別に切り出し、タンパク質配列決定と質量分析を用いて分析できます。NCの構造成分は互いに分離することができ（例えば、針状部分と基部部分）、それらの画分を分析することで、それぞれの成分に関与するタンパク質を推測できます。あるいは、単離されたNCは、事前の電気泳動なしに質量分析によって直接分析し、 NCプロテオームの全体像を得ることもできます。

遺伝学的および機能的研究

多くの細菌のT3SSは、研究者によって操作されてきました。個々の操作の影響を観察することで、システムの各成分の役割についての洞察を得ることができます。操作の例は次のとおりです。

  • 1つまたは複数のT3SS遺伝子の削除（遺伝子ノックアウト）。
  • 1つまたは複数のT3SS遺伝子の過剰発現（言い換えれば、通常よりも多くの量のT3SSタンパク質の生体内産生）。
  • T3SS遺伝子またはタンパク質の点的または局所的な変化。これは、タンパク質内の特定のアミノ酸または領域の機能を定義するために行われます。
  • ある細菌種から別の細菌種への遺伝子またはタンパク質の導入（相互補完アッセイ）。これは、2つのT3SS間の相違点と類似点を確認するために行われます。

T3SS成分の操作は、細菌の機能と病原性のいくつかの側面に影響を及ぼす可能性があります。考えられる影響の例：

  • 細胞内病原体の場合、細菌が宿主細胞に侵入する能力。これは、侵入アッセイ（ゲンタマイシン防御アッセイ）を使用して測定できます。
  • 細胞内細菌が宿主細胞間を移動する能力
  • 細菌が宿主細胞を殺す能力。これはいくつかの方法で測定できますが、例えば、LDH遊離アッセイでは、死んだ細胞から漏出する酵素LDHをその酵素活性を測定することで特定します
  • T3SSが特定のタンパク質を分泌する能力、あるいはそもそも分泌しない能力。これを評価するには、液体培地中で増殖する細菌に分泌を誘導する。次に、細菌と培地を遠心分離で分離し、培地画分（上清）中の分泌タンパク質の存在を調べる。通常分泌されるタンパク質の分泌を阻害するために、巨大分子を人工的に付加することができる。この時、分泌されないタンパク質が針状複合体の底部に「留まった」状態であれば、分泌は効果的に阻害される。
  • 細菌が完全な針状複合体を組み立てる能力。NCは操作された細菌から分離し、顕微鏡で観察することができます。しかし、小さな変化は顕微鏡で必ずしも検出できるとは限りません。
  • 細菌が生きた動物や植物に感染する能力。操作された細菌が試験管内で宿主細胞に感染できることが示されたとしても、生きた生物内で感染を維持する能力は当然のことではありません。
  • 他の遺伝子の発現レベル。これは、ノーザンブロット法やRT-PCR法など、いくつかの方法で評価できます。ゲノム全体の発現レベルは、マイクロアレイで評価できます。これらの方法を用いて、多くのIII型転写因子と調節ネットワークが発見されました。
  • 細菌の増殖と適応度

T3SS阻害剤

グラム陰性細菌においてT3SSを阻害する化合物がいくつか発見されており、その中にはストレプトマイセス属によって天然に産生されるグアジノミンが含まれます。[38] T3SSを阻害するモノクローナル抗体も開発されています。 [39] T3SSタンパク質の翻訳を阻害できる抗生物質であるオーロドックスは、in vitroおよび動物モデルにおいてT3SSエフェクターを阻害できることが示されています。[40] [41]

III型シグナルペプチド予測ツール

  • 有効T3

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さらに詳しく

  • 英国王立化学協会によるインジェクティソームの化学に関する即時の洞察
  • Pseudomonas syringae pv. tomatoとトマトにおける宿主-病原体相互作用による細菌斑点病の発生
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