ホスホジエステラーゼ2

リン酸が棒状、触媒金属が球状で示されたPDE2の構造。（PDB：1Z1L）

PDE2 （ホスホジエステラーゼ2）酵素は、哺乳類に存在する21種類のホスホジエステラーゼ（PDE）の1つです。これらの異なるPDEは、11のファミリー（PDE1～PDE11）に分類されます。同じファミリーに属する異なるPDEは、アミノ酸配列にかなりの相違が見られるにもかかわらず、機能的に関連しています。[ 1 ] PDEはそれぞれ異なる基質特異性を有します。cAMP選択性加水分解酵素（ PDE 4、-7、-8）、cGMP選択性加水分解酵素（PDE 5、-6、-9）、そしてcAMPとcGMPの両方を加水分解できる酵素（PDE1、-2、-3、-10、-11）があります。[ 2 ]

PDE2をコードする遺伝子ファミリーはPDE2Aのみである。3つのスプライスバリアント、すなわちPDE2A1、PDE2A2、PDE2A3が見つかっている（PDE2A2はラットでのみ発見されている）。PDE2A1は細胞質に局在するのに対し、PDE2A2とPDE2A3は膜結合型である。PDE2A2とPDE2A3の局在が異なるのは、PDE2A1には存在しないN末端配列に起因すると示唆されている。PDE2Aのスプライスバリアントはそれぞれ異なるものの、それらの動態挙動に違いは知られていない。[ 3 ]

結晶構造

PDE2酵素の活性部位の結晶構造が報告されている。 [ 4 ] PDEファミリーのメンバーのアミノ酸配列はかなりの違い（25-35%の同一性）を示しているが、活性部位の全体的な折り畳み、機能的および構造的要素は非常に類似している。活性部位は、すべてのPDE間で高度に保存されている残基によって形成される。結合ポケットには金属イオン（亜鉛およびマグネシウム）結合部位がある。亜鉛を結合する2つのヒスチジン残基と2つのアスパラギン酸残基は、研究されたすべてのPDE間で保存されている。[ 3 ]他のいくつかのPDEアイソザイムの構造が解明されており、その中には活性部位に阻害剤が存在する共結晶構造がいくつかある。 [ 5 ] PDE4B、PDE4DおよびPDE5 Aの共結晶構造は、 PDEへの阻害剤結合の2つの共通特徴を明らかにした。一つは酵素の活性部位に整列する阻害剤の平面環状構造であり、もう一つはヌクレオチドの認識と選択性に必須である保存されたグルタミン残基（後述する「グルタミンスイッチ」）である。 [ 1 ] [ 5 ] [ 6 ]

基質選択性

cAMP（左）とcGMP（右）。PDE2の天然基質。

前述のように、PDE2はcAMPとcGMPの両方を加水分解できますが、PDEファミリーの他のメンバーはどちらかの環状ヌクレオチドに対して選択的です。cAMPまたはcGMPのいずれかに対する選択性の変動は、いわゆる「グルタミンスイッチ」によって決定されると考えられています。「グルタミンスイッチ」は、結晶構造が解明されているすべてのPDEに見られる不変のグルタミンです。PDE2では、この残基はGln859です。これは、 cAMPの環外アミノ基およびcGMPの環外カルボニル酸素と水素結合を形成する可能性があります。cAMPとcGMPの両方を加水分解できるPDEでは、このグルタミンは自由に回転できます。cAMPまたはcGMPのいずれかに選択的なPDEでは、このグルタミンは隣接する残基によって、どちらかの環状ヌクレオチドに対する選択性を高める位置に拘束されます。[ 1 ] [ 3 ]

規制

cGMPがPDEのアロステリックGAF-Bドメインに結合すると、タンパク質構造に立体構造変化が起こり、酵素活性が上昇する。cGMPがGAF-Bドメインに結合することでcAMPの加水分解が促進されることはよく知られているが、その逆の例は知られていない。[ 3 ] GAF - BドメインはcAMPに対してcGMPよりも30～100倍低い親和性を示すことが示されている。[ 7 ]この情報と、細胞内cAMP濃度に関する現在の知見を組み合わせると、 cAMPによるcGMP加水分解の活性化が生体内で起こる可能性は低いことがわかる。[ 3 ]

PDE2の臨床的価値

PDE2は、副腎髄質、脳、心臓、血小板、マクロファージ、内皮細胞など、様々な組織に発現しています。この酵素は、以下のような様々な細胞内プロセスの制御に関与していると考えられています。[ 3 ] [ 8 ]

PDE2についてはいくつかの酵素機能が報告されている。PDE2は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）によって引き起こされるcGMPの増加を介してcAMPを低下させ、アルドステロン分泌を減少させることが示されている。[ 3 ]また、PDE2は、血小板中のcAMPとcGMPの細胞内濃度の上昇の調節に重要な役割を果たす可能性が示唆されている。PDE3は血小板凝集において重要な役割を果たしている。cGMPの濃度が上昇するとPDE3は阻害され、PDE2は刺激されると報告されている。これら2つの機能の相互作用により、血小板中のcAMPの相反する調節が媒介されていると思われる。[ 3 ] PDE2は心筋細胞内の心臓L型Ca 2+電流を制御し、cGMPによるPDE2の活性化によってcAMPが低下し、それによって心機能に影響を及ぼします。[ 3 ]しかし、最近、心筋細胞内に存在する異なるcAMPプールが異なる（時には相反する）効果を媒介することがわかった。異なるPDEタイプが異なるcAMPプールに影響を及ぼす可能性があるため、異なるPDEが細胞内の異なるプロセスを制御している可能性がある。[ 9 ] PDE2は脳のいくつかの領域で発現しており、ラットの実験では、PDE2の阻害が記憶などの機能を強化することが示されている。[ 3 ]単球がマクロファージに分化するときにPDE2のアップレギュレーションが行われるが、成熟したマクロファージにおけるPDE2の役割はまだ明らかにされていない。さらに、PDE2は微小血管では検出されているが大血管では検出されていないことから、炎症反応において役割を果たしていると示唆されている。腫瘍壊死因子α （TNFα）が内皮細胞内のPDE2の機能を制御し、それによって内皮バリアを通過する体液と細胞の流れに影響を与えるのではないかと推測されている。これは、内皮細胞に対するin vitro実験でPDE2 mRNAと活性の両方が制御されていることが示されているためである。 [ 3 ]これまでPDE2阻害剤は主に研究ツールとして使用されてきましたが、現在では記憶力の改善、炎症状態における内皮透過性の低下、[ 3 ]心不全と心臓肥大の予防/改善について研究されています。[ 10 ]

PDE2A阻害剤

PDE2阻害剤
エナ
オキシインドール
ベイ60-7550
PDP

エナ

PDE2に対して開発された最初の特異的阻害剤はEHNA（エリスロ-9-(2-ヒドロキシ-3-ノニル)アデニン）であった。EHNAは、PDE2のcGMP活性化をIC 50値約1μMで阻害し、他のPDEに比べて少なくとも50倍の選択性を示すことで、PDE2に特異的に作用することが実証されている。[ 11 ] EHNAのコア構造はcAMPに類似しているが、cAMPのリン酸化リボース部分をEHNAが嵩高い疎水性炭素側鎖で置換している点でcAMPと異なる。[ 1 ]

EHNAの阻害効果

ラット皮質ニューロンの初代培養において、EHNAによるPDE2Aの阻害はNMDA（N-メチル-D-アスパラギン酸）受容体活性化cGMP増加を増強するが、cAMP濃度には影響を及ぼさない。[ 12 ] EHNAはIC 50が約2 nMの 非常に強力なアデノシンデアミナーゼ阻害剤でもある。[ 13 ]この二重阻害は2つの阻害代謝物、アデノシン[ 13 ] [ 14 ]とcGMP [ 12 ] [ 15 ]の蓄積につながり、これらは相乗的に作用して抗ウイルス、抗腫瘍、抗不整脈効果を含む多様な薬理学的反応を媒介する可能性がある。[ 11 ] EHNAはアデノシンデアミナーゼを強力に阻害するが、適切な制御を行えばPDE2機能を調べるツールとして効果的に使用されている。 EHNAは心筋細胞におけるカルシウム制御におけるPDE2の関与を研究するために使用されており[ 16 ]、灌流肺モデルにおける低酸素性肺血管収縮を逆転させる効果があることが示されている。[ 17 ] したがって、EHNAは次の2つの目的で使用されている。

  1. より選択的で強力なPDE2阻害剤の合理的設計のためのリード構造として役立つこと、および
  2. PDE の生物学的ターゲットのいくつかを定義します。

しかし、PDE2の薬理学的役割を決定するための化学的ツールとしてのEHNAの使用は、PDE2阻害力が低く、アデノシンデアミナーゼ阻害力が高いため、限界がある。[ 18 ]理論的には、アデノシンデアミナーゼ阻害の結果としてEHNAによって蓄積されるアデノシンの影響を考慮し、補正すれば、この問題は解決できる。この方法により、PDE2阻害の結果としてEHNAによって誘発される陽性変力作用が観察された。[ 19 ] [ 20 ]

BAY 60-7550、オキシンドールおよびPDP

BAY 60-7550はEHNAの類似体であり、100倍以上の効力があり、PDE2Aに対して高い選択性を示します。[ 13 ]他の新たに発見された選択的PDE2阻害剤には、PDP（9-（6-フェニル-2-オキソヘキサ-3-イル）-2-（3,4-ジメトキシベンジル）-プリン-6-オン）[ 21 ]とオキシンドール[ 18 ]があります。

PDE2阻害剤
阻害剤 IC 50参照
エナ 1μM [ 11 ]
オキシインドール 40 nM [ 16 ]
ベイ60-7550 4.7 nM [ 13 ]
PDP 0.6 nM [ 21 ]

上の表は、 EHNAを含むPDE2阻害剤の効力を示しています。EHNA、Bay 60-7550、およびPDPの間では、効力が大きく増加しています。Bay-60-7550とPDPのプリン残基の2位にある大きなジメトキシベンジル基が、この効力増加に寄与している可能性があります。

阻害剤の構造と結合

これらの阻害剤を酵素の天然基質であるcAMPおよびcGMPと比較すると、分子に共通する特徴がいくつか明らかになる。すべての分子に共通する主な特徴は、少なくとも2つの縮合環構造（6原子環と5原子環）からなる平面構造である。cGMPおよびcAMPのこの環系はプリン環系であり、EHNAおよびPDPも同様である。Bay 60-7550およびオキシインドールはプリン核を欠いているが、関連する環系を有している。阻害剤の環系には、主に窒素であるが酸素も含まれる水素結合受容体が存在する。これらの原子は、酵素の活性部位のアミノ酸の一部である水素結合供与体と相互作用し、天然基質が活性部位に結合するのと同様に、酵素によるcAMPおよびcGMPの加水分解を阻害すると考えられる。[ 1 ]

阻害剤の構造類似性

Bay 60-7550とPDPの構造は非常に類似しています。これらの分子の違いは、Bay 60-7550の環外メチル基です。この基はPDPの窒素原子を置換するため、基質と阻害剤の結合に重要な部位で酵素と水素結合を形成する可能性が低くなります。オキシンドールの構造は、プリン環系からより離れており、水素結合の可能性が低いため、他の阻害剤とは異なります。また、この分子には、Bay 60-7550とPDPのジメトキシベンジル基に類似した大きな側鎖基がありません。この現象の共結晶構造がなければ、酵素との相互作用を予測することは困難です。

PDE2阻害剤の考えられる構造活性相関

PDE2の活性部位に結合した阻害剤の共結晶構造は未だ確立されていない。しかしながら、阻害剤EHNAと触媒部位に結合した基質cAMPおよびcGMPとのコンピュータドッキングモデルは作成されている。 [ 1 ] EHNAのドッキングモデルは、活性部位のアミノ酸Asp811をAla（Asp811Ala）に、およびIle826をVal（Ile826Val）に変異させた場合にのみ、EHNAによる阻害に有意な影響を与えることを示した。Asp811をアラニンに変異させるとEHNAのIC 50値が6倍に増加し、Ile826をバリンに変異させると野生型PDE2Aと比較してEHNAのIC 50値が7倍に増加する。 [ 1 ]

上部結合ポケット: Gln859 と Asp811

EHNAは活性部位のGln859に近接しており、EHNAのアデニン環の窒素原子N1とN6に2つの水素結合を供与する可能性があります。結合ポケットのもう一方の部位では、Asp811がアデニン環のN7に別の水素結合を供与し、結合阻害剤を安定化させる可能性があります。この仮説は、Asp811Ala変異体がcAMPに対する活性が低下している一方で、cGMPに対する活性は変化していないという事実によって裏付けられています。[ 1 ]

下部綴じポケット：Ile 826

下部結合ポケットの残基は阻害剤と相互作用するには遠すぎるため、EHNA選択性には無関係である可能性がある。しかし、これらの残基はEHNA選択性に間接的な役割を果たす可能性がある。Ile826はEHNAのプリン環の下に位置しているため、EHNAの空間を制限している。より小さなバリンへの置換（Ile826Val変異）は、EHNAの空間を拡大し、上部結合ポケットの残基との水素結合を喪失させる一方で、下部結合ポケット内の水素結合を改善する可能性がある。この相互作用の変化はEHNAのアデニン環の結合を不安定化し、IC 50値が上昇する原因となる可能性がある。[ 1 ]

EHNA以外の阻害剤については、活性部位に整列するモデルが存在しない。そのため、分子結合の解釈はより困難である。阻害剤とその全体的な類似性を考慮すると、それらは活性部位に同様のメカニズムで結合し、異なる側鎖基が阻害剤の効力を決定している可能性が高い。PDE2活性部位における阻害剤特異性の決定因子はあまりよく分かっていないが、これらの決定因子をより深く理解することで、より強力な阻害剤の開発が促進されるだろう。[ 1 ]

参考文献

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